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.2008年6月16日；181(6):893-901.
doi:10.1083/jcb.200712028。 Epub 2008年6月9日。

Mps1激酶活性在有丝分裂未受干扰期间抑制后期，并将Mad2靶向动粒

安东尼·提格 1, 奥利弗·斯塔普斯, 斯蒂芬-泰勒
附属公司

Mps1激酶活性在有丝分裂未受干扰期间抑制后期，并将Mad2靶向动粒

安东尼·提格等。 J细胞生物学. .

摘要

Mps1是纺锤体组装检查点的上游组件，在人类细胞中，它是激活检查点以响应纺锤体损伤所必需的，但在有丝分裂未受干扰期间并不明显。Mps1还招募Mad1和Mad2加入kinetochores。然而，这些过程是否需要Mps1的酶活性尚不清楚。为了解决这个问题，我们建立了RNA干扰（RNAi）互补分析。Mps1的抑制会导致后期提前，通常伴有未对齐或定向错误的染色体。该表型由抗RNAi野生型Mps1转基因挽救，但不由催化失活突变挽救。类似物敏感等位基因Mps1（M602A）也可以挽救RNAi诱导的缺陷，但当被三磷酸腺苷类似物1-NM-PP1抑制时，则不能。因此，在有丝分裂未受干扰期间，Mps1活性确实会抑制后期。此外，虽然催化失活的Mps1可以恢复Mad1的动粒定位，但只有活性激酶恢复Mad2的定位。因此，在人类细胞中，Mps1催化活性是纺锤体检查点功能和Mad2招募所必需的。

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数字

图1。
图1。
在有丝分裂未受干扰期间，纺锤体检查点功能需要Mps1。通过延时显微镜分析与对照或Mps1 shRNA和GFP组蛋白H2B构建物共同转染的HeLa细胞。（A） 显示从最后一条染色体对齐（箭头）到后期开始的时间（以分钟为单位）的图像序列。（B） 条形图量化了对照细胞和Mps1缺陷细胞从NEB到中期以及从中期到后期所用的时间。值表示从至少62个单元格得出的平均值和SEM（误差条）。（C） 条形图量化了在对照细胞或Mps1缺陷细胞中观察到的有丝分裂异常。棒，5μm。
图2。
图2。
主轴检查点功能需要Mps1激酶活性。用shRNA载体转染表达tet-inducible RNAi-resistance GFP-tagged Mps1融合物的HeLa细胞，并通过免疫荧光显微镜、免疫印迹和延时显微镜进行分析。（A） 免疫荧光图像显示野生型Mps1（WT）的动粒定位R（右）)和催化失活的D664A突变体（KDR（右）). （B） 免疫印迹显示内源性Mps1的抑制和RNAi抗性GFP标记蛋白的诱导。（C） 量化内源性Mps1抑制后观察到的有丝分裂表型的条形图；而Mps1 WTR（右）挽救RNAi缺陷，Mps1 KDR（右）加重表型。每个类别中至少有132个细胞被评分。棒材，5μm。
图3。
图3。
Mps1激酶活性是Mad2动粒定位所必需的。用shRNA载体转染表达tet-inducible RNAi-resistance GFP-tagged Mps1融合物的HeLa细胞，用诺卡唑处理2 h，并分析以检测着丝粒（ACA；红色）和Mad1或Mad2（绿色）。（A） 去卷积图像堆栈显示，尽管Mps1 WTR（右）恢复Mad2本地化，Mps1 KDR（右）没有。突出显示的（方框中的）动粒的放大显示Mad1或Mad2的存在或不存在。（B） 根据ACA信号标准化的动粒量化Mad1和Mad2像素强度的条形图。数值表示从至少九个细胞的至少106个动粒中得出的平均值和SEM（误差条）。（C） 绘制用Mps1 KD重组细胞动粒中Mad1和Mad2数量的条形图R（右）用Mps1 WT重组的百分比表示R（右）巴，5μm。
图4。
图4。
对Mps1激酶活性的化学遗传抑制抑制检查点和Mad2定位。用shRNA载体转染表达tet-inducible RNAi-resistance GFP-tagged Mps1融合物的HeLa细胞，并通过延时显微镜和免疫荧光分析。（A） 量化内源性Mps1抑制后观察到的有丝分裂表型的条形图；Mps1的能力M602A型1-NM-PP1可逆转RNAi缺陷。（B） 染色细胞的去卷积图像堆栈的投影用于检测着丝粒（ACA；红色）和Mad2（绿色），表明Mps1的能力m602毫米1-NM-PP1逆转了Mad2的动粒定位。（C） 根据ACA信号标准化的动粒量化Mad2像素强度的条形图。值表示从至少四个细胞的至少64个动粒中得到的平均值和SEM（误差条）。棒材，5μm。
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