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比较研究
.2008年6月15日；180(12):8250-61.
doi:10.4049/jimmunol.180.12.8250。

巨噬细胞迁移抑制因子的利什曼原虫同源基因调节宿主巨噬细胞反应

丹妮拉·卡米尔 1, 斯文·齐罗, 林冷, Yoonsang Cho公司, 伊拉·迪亚兹, 杰森·格里菲斯, 考特尼·麦克唐纳, 梅兰妮·默克, 罗伯特·米切尔, 特伦德, 陈一邦, 袁坤Amy Kwong, 熊华宝, 乔恩·弗迈尔, 迈克尔·卡佩罗, 黛安·麦克马洪·普拉特, 尊尼获加, 尤尔根·伯恩哈根, 埃利亚斯·洛利斯, 理查德·布卡拉
附属公司
比较研究

巨噬细胞迁移抑制因子的利什曼原虫同源基因调节宿主巨噬细胞反应

丹妮拉·卡米尔等。 免疫学杂志. .

摘要

寄生虫已经进化出专门的策略来逃避免疫防御机制。我们在本文中描述了细胞因子的直系同源物，巨噬细胞迁移抑制因子（MIF），其由专性细胞内寄生虫主要利什曼原虫产生。高分辨率x射线晶体结构（1.03A）显示，利什曼原虫MIF蛋白Lm1740MIF与人MIF具有显著的结构同源性。N端互变异构化位点的两种蛋白质之间存在明显差异，我们为靶向该位点的小分子拮抗剂选择性、物种特异性抑制MIF提供了证据。Lm1740MIF与MIF受体CD74（K（d）=2.9 x 10（-8）M）有显著的结合作用。与哺乳动物类似，Lm1740MIF以CD74依赖的方式诱导ERK1/2 MAP激酶活化，并抑制活化诱导的巨噬细胞凋亡。Lm1740MIF抑制凋亡的能力可能有助于利什曼原虫在巨噬细胞内的持续存在，并有助于其避免免疫破坏。

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数字

图1
图1
MIF样序列利什曼原虫.一个，的物理图L.主要包含核苷酸804882−806078的33号染色体区域。这两个mif公司-相关基因Lm1740（登录号Q4Q413）和Lm1750（登录编号Q4Q4013）与共有TATA-box和多腺苷化信号序列一起显示。B类，寄生MIF蛋白序列的系统发育图，包括五个mif公司-相关蛋白在利什曼原虫物种大乳杆菌、婴儿乳杆菌、和巴西乳杆菌s.顺序C.植物酵母菌用于解决MIF表达寄生虫之间的关系。在引导测试（5000次重复）中，相关分类群聚集在一起的复制树的百分比显示在分支旁边。进化距离是使用泊松校正方法计算的，以每个位点的氨基酸替换数为单位。基因登录号为：婴儿乳杆菌，2100 XM_001468253；婴儿乳杆菌，2090 XM_001468252；巴西乳杆菌，CAM40731；L.major1740，2013年第4季度；L.major 1750年，第4季度第412季度弓形虫，DQ344450；无球虫艾美耳球虫，DQ323516；柔嫩艾美耳球虫，DQ323515；单纯钩虫，EF165010；班克罗夫蒂Wichereria bancrofti，AF040629；约氏疟原虫，DQ494171；恶性疟原虫，AY561832；查巴迪疟原虫，CAH75532；伯氏疟原虫，CAH99597；鞭毛虫，AJ237770；旋毛虫，AY050661；猪蛔虫，AB158366；溶组织内阿米巴，XM_650516；盲肠杆菌，EF410151；B.马来语（1），AF002699；B.马来语（2），AY004865；卷尾螺mif-1。AF384027；O.volvulus mif-2，AF384028.C型，用T-Coffee程序构建的选定MIF分子的氨基酸序列比对（19）。共识线表示每个残留物：*，完全守恒；：，残留物大小和亲水性的保护。，保持大小或亲水性。颜色代码评估多重排列和每对排列的残基之间的一致性（59）。中等灰色方框，位不一致，不太可能正确对齐；浅灰色、中灰色和深灰色方框，比特对应的残留物更有可能正确对齐（深灰色是最可靠的部分）。一致性表示每个残留物柱的平均可靠性值。其他基因登录号为：A.美国，Q9GUA9；五倍子，Q02960；小肌肉，第34884页；智人，Q6FHV0；猕猴，Q6DN04；苏斯·斯科法，Q069I4。
图1
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MIF样序列利什曼原虫.一个，的物理图L.主要包含核苷酸804882−806078的33号染色体区域。这两个mif公司-相关基因Lm1740（登录号Q4Q413）和Lm1750（登录编号Q4Q4013）与共有TATA-box和多腺苷化信号序列一起显示。B类，寄生MIF蛋白序列的系统发育图，包括五个mif公司-相关蛋白在利什曼原虫物种大乳杆菌、婴儿乳杆菌、和巴西乳杆菌s.顺序C.植物酵母菌用于解决MIF表达寄生虫之间的关系。在引导测试（5000次重复）中，相关分类群聚集在一起的复制树的百分比显示在分支旁边。进化距离是使用泊松校正方法计算的，以每个位点的氨基酸替换数为单位。基因登录号为：婴儿乳杆菌，2100 XM_001468253；婴儿乳杆菌，2090 XM_001468252；巴西乳杆菌，CAM40731；L.major1740，2013年第4季度；L.major 1750年，第4季度第412季度弓形虫，DQ344450；无球虫艾美耳球虫，DQ323516；柔嫩艾美耳球虫，DQ323515；单纯钩虫，EF165010；班克罗夫蒂Wichereria bancrofti，AF040629；约氏疟原虫，DQ494171；恶性疟原虫，AY561832；查巴迪疟原虫，CAH75532；伯氏疟原虫，CAH99597；鞭毛虫，AJ237770；旋毛虫，AY050661；猪蛔虫，AB158366；溶组织内阿米巴，XM_650516；盲肠杆菌，EF410151；B.马来语（1），AF002699；B.马来语（2），AY004865；卷尾螺mif-1。AF384027；O.volvulus mif-2，AF384028.C型，用T-Coffee程序构建的选定MIF分子的氨基酸序列比对（19）。共识线表示每个残留物：*，完全守恒；：，残留物大小和亲水性的保护。，保持大小或亲水性。颜色代码评估多重排列和每对排列的残基之间的一致性（59）。中等灰色方框，位不一致，不太可能正确对齐；浅灰色、中灰色和深灰色方框，比特对应的残留物更有可能正确对齐（深灰色是最可靠的部分）。一致性表示每个残留物柱的平均可靠性值。其他基因登录号为：A.美国，Q9GUA9；五倍子，Q02960；小肌肉，第34884页；智人，Q6FHV0；猕猴，Q6DN04；苏斯·斯科法，Q069I4。
图2
图2
Lm1740MIF和Lm1750MIF mRNA表达于L.主要.实时qPCR分析来自L.主要体外培养的原环和亚环形式，以及来自小鼠感染淋巴结内的无鞭毛体。对Lm1740MIF和Lm1750MIF转录物相对于内部对照mRNA rRNA45进行了实验(一个)和ADP/ATP载体(B类). 所有样品一式三份。这个第页值由Student的t吨测试**，第页<0.01，对于前循环药物与亚循环药物或无鞭毛菌；*，第页前环类与亚环类或无鞭毛类的差异<0.05。
图3
图3
Lm1740MIF蛋白的生化特性。一个在Superdex 75 10/300 GL柱上对从尺寸排除色谱洗脱的重组Lm1740MIF蛋白组分进行SDS/PAGE和考马斯染色分析。性病、蛋白质分子质量标准。B类，显示分子质量的Lm1740MIF的电喷雾电离质谱(米/z)其精度在预测值的0.02%以内米/z（12381.22 Da）。C类，用底物测量Lm1740MIF和人MIF的互变异构活性，d日-多巴色素甲酯。Lm1740MIF的代表性反应显示为1μM，人体MIF为0.1μM.小分子抑制剂ISO-1或4-IPP分别以1000倍或1倍摩尔过量与MIF预孵育。Lm1740MIF的互变异构酶活性较低，因此有必要使用较高浓度的该蛋白进行抑制研究。数据是三次测量的平均值±SD。这个第页值由Student的t吨测试*，第页人类MIF与Lm1740MIF、4-IPP治疗的Lm1740 MIF与未治疗的Lm 1740 MIFs、ISO-1或4-IPP处理的人类MIF vs未治疗的人类MIFs以及4-IPP-治疗的Lm2 740 MIFvs 4-IPP治疗的人类MIF-s均<0.001。
图4
图4
Lm1740MIF和MIF之间的保守结构。一个，Lm1740MIF和人类MIF原生质体的示意图(顶部)和三聚体(底部)二级结构元素以蓝色显示(β薄板），红色(α螺旋）和青色（随机线圈）。B类，单体和三聚体Lm1740MIF（红色）和人MIF（绿色）的骨干带状图的重叠位置。在三聚体表示法中，其中一个原体显示为骨架痕迹。三聚体表示中还显示了与底物识别有关的侧链残基。基板第页-羟基苯丙酮酸以黄色显示。C类，Lm1740MIF和人MIF互变异构酶位点的静电表面电势(顶部). 带负电荷的表面电位显示为红色，正电位显示为蓝色。基于MIF晶体结构的Lm1740MIF底物接触活性位点残基分子模型第页-丙酮酸氢苯酯(底部; 参考40）。残留物编号参考图1的序列比对C类Molscript（58）程序用于准备一个，PyMOL（59）用于制备B类和C类(下部面板)，SPOCK（60）用于生成C类(上部面板).
图5
图5
Lm1740MIF与MIF受体CD74结合，并被巨噬细胞内吞。一个，Lm1740MIF和人MIF与固定化的人MIF受体外域（sCD74）的浓度依赖性结合，使用生物素化的人MI F作为竞争物。中和型抗MIF受体单克隆抗体（LN2）和热变性重组人MIF作为本试验的阳性和阴性对照。值是四次测量的平均值。B类，重组Lm1740MIF和sCD74之间相互作用的实时表面等离子体共振分析（BIAcore）。C类，外源性添加的Lm1740MIF被RAW 264.7巨噬细胞内化。将荧光素标记的Lm1740MIF或人MIF（绿色）添加到1.5μM、 和染色β-30分钟后进行肌动蛋白（红色），如材料和方法.
图6
图6
Lm1740MIF诱导单核细胞迁移。在下腔中加入或不加入8.1 nM（100 ng/ml）重组Lm1740MIF，对人PBMC进行迁移分析。人MIF作为阳性对照。MIF抑制剂ISO-1以10倍、100倍和1000倍摩尔过量添加到重组蛋白中，抑制剂4-IPP以10倍摩尔过量加入。结果代表了2个独立实验，并表示为12个计数场的平均数±SE第页值由Student的t吨测试**，第页<0.01、***、，第页< 0.001. 用于Lm1740或人MIF与具有抑制剂的蛋白质的比较。
图7
图7
LmMIF保护巨噬细胞免受凋亡，并以MIF受体依赖的方式激活信号转导。一个用编码Lm1740MIF、Lm1750MIF的质粒、小鼠MIF（MIF）或对照载体转染小鼠RAW264.7单核细胞。20小时后添加NO供体SNP，并通过ELISA评估DNA片段。数据是五个实验的平均值±标准差。这个第页值由Student的t吨测试**，第页<0.01，第页MIF vs矢量控制<0.05。**，第页<0.01，第页Lm1740MIF vs MIF和Lm1750MIF vs MIF<0.05。***，第页RAW264.7与SNP治疗的病媒对照组相比<0.001。的值第页>0.05不显示。B类在添加凋亡诱导剂SNP之前，用Lm1740MIF或小鼠MIF处理野生型（WT）BMM。36小时后用ELISA检测DNA片段。这个第页值由Student的t吨测试**，第页<0.01，第页MIF与SNP对照组<0.05。**，第页< 0.01, **,第页Lm1740MIF vs MIF<0.05。**，第页对照组与SNP添加组之间的差异<0.01。的值第页>0.05不显示。使用特异性磷酸化ERK1/2、总ERK1/2和磷酸化p53和总p53 Abs，通过Western blotting评估ERK1/2与p53的磷酸化。如图所示，BMM采用NO供体SNP治疗。C3H/HeJ骨髓巨噬细胞ERK1/2磷酸化的Western blotting作为LPS污染的对照。C类制备来自MIF受体缺陷（CD74-KO）小鼠的BMM，并研究其对细胞凋亡、ERK1/2磷酸化和磷酸化p53含量的保护作用B类. The第页值由Student的t吨测试。***，第页<0.001，对照组vs SNP添加组。这个第页用于与进行比较的值第页>0.05不显示。凋亡研究和Western blots都是至少四个独立进行的实验的代表。
图7
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LmMIF保护巨噬细胞免受凋亡，并以MIF受体依赖的方式激活信号转导。一个用编码Lm1740MIF、Lm1750MIF的质粒、小鼠MIF（MIF）或对照载体转染小鼠RAW264.7单核细胞。20小时后添加NO供体SNP，并通过ELISA评估DNA片段。数据是五个实验的平均值±标准差。这个第页值由Student的t吨测试**，第页<0.01，第页MIF vs矢量控制<0.05。**，第页<0.01，第页Lm1740MIF vs MIF和Lm1750MIF vs MIF<0.05。***，第页RAW264.7与SNP治疗的病媒对照组相比<0.001。的值第页>0.05不显示。B类在添加凋亡诱导剂SNP之前，用Lm1740MIF或小鼠MIF处理野生型（WT）BMM。36小时后用ELISA检测DNA片段。这个第页值由Student的t吨测试**，第页<0.01，第页MIF与SNP对照组<0.05。**，第页< 0.01, **,第页Lm1740MIF vs MIF<0.05。**，第页对照组与SNP添加组之间的差异<0.01。的值第页>0.05不显示。使用特异性磷酸化ERK1/2、总ERK1/2和磷酸化p53和总p53 Abs，通过Western blotting评估ERK1/2与p53的磷酸化。如图所示，BMM采用NO供体SNP治疗。C3H/HeJ骨髓巨噬细胞ERK1/2磷酸化的Western blotting作为LPS污染的对照。C类制备来自MIF受体缺陷（CD74-KO）小鼠的BMM，并研究其对细胞凋亡、ERK1/2磷酸化和磷酸化p53含量的保护作用B类. The第页值由Student的t吨测试。***，第页<0.001，对照组vs SNP添加组。这个第页用于与进行比较的值第页>0.05不显示。凋亡研究和Western blots都是至少四个独立进行的实验的代表。
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