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.2008年8月；26(8):2104-13.
doi:10.1634/stemcells.2008-0115。 Epub 2008年5月29日。

肝星状细胞是成年小鼠肝脏上皮祖细胞的命运图证据

刘洋 1, 容美美（Youngmi Jung）, 阿莱西亚·奥梅内蒂, 拉斐尔·维特克, 史蒂夫·崔, 亨德里卡·M·万东根, 黄佳文, 吉安弗兰科·阿尔皮尼, 安娜·梅·迪尔
附属公司

肝星状细胞是成年小鼠肝脏上皮祖细胞的命运图证据

刘洋等。 干细胞. 2008年8月.

摘要

肝损伤激活静止的肝星状细胞（Q-HSC），使其增殖为肌成纤维细胞。肌纤维母细胞肝星状细胞（MF-HSC）的积聚有时会导致肝硬化和肝衰竭。然而，MF-HSC还通过为卵圆细胞、肝细胞和胆管细胞的双功能祖细胞产生生长因子来促进肝再生。原代肝星状细胞（HSC）分离株表达的基因与卵圆细胞表达的基因重叠，在一定条件下培养HSC时，肝细胞和导管细胞出现。我们评估了以下假设：HSC是一种卵圆细胞，因此能够生成肝细胞以再生受损的肝脏。由于Q-HSC表达胶质纤维酸性蛋白（GFAP），我们将GFAP启动子元件调控Cre重组的小鼠与ROSA-loxP-stop-loxP-绿色荧光蛋白（GFP）小鼠杂交，生成GFAP-Cre/GFP双转基因小鼠。给这些小鼠喂食蛋氨酸胆碱缺乏、补充蛋氨酸的饮食，以激活和扩大HSC和卵圆细胞群。GFAP表达前体的GFP（+）子代通过免疫组织化学进行表征。GFAP（+）Q-HSC中间充质标志物的基本表达可以忽略不计。当肝损伤或培养激活时，HSC下调GFAP的表达，但保持GFP（+）；它们变得高度增殖，并开始共存间充质和卵圆形细胞的标记。当表达GFP的肝细胞出现时，这些移行细胞消失，开始表达白蛋白，并最终在大面积肝实质中重新聚集。导管细胞也表达GFAP和GFP，但在该模型中其增殖活性没有增加。这些发现表明，HSC是一种卵圆细胞，在肝再生过程中分化为肝细胞之前，先经过间充质阶段过渡。在本文末尾可以发现潜在利益冲突的披露。

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数字

图1
图1。GFAP、Cre重组酶和GFP在对照和GFAP-Cre/报告小鼠HSC中的表达
在代表性对照（Ctr）（A–C）和GFAP-Cre/GFP（TG）小鼠（D–F）中进行GFAP（A，D）、Cre-reguse（B，E）和GFP（C，F）免疫组化。GFAP在代表性Ctr小鼠（a）和代表性GFAP-Cre/GFP（TG）小鼠（D）中由肝星状细胞（HSC）表达。HSC在TG小鼠中表达Cre重组酶（E）和GFP（F），而在Ctr小鼠（B，C）中不表达。（X100）
图2
图2。GFAP-Cre/报告小鼠胆管细胞中GFAP、Cre重组酶和GFP的表达
GFAP（A）、Cre-relubise（B）和GFP（C）由具有代表性的GFAP-Cre/GFP（TG）小鼠的门静脉三联体中的胆管细胞表达。代表性GFAP-Cre/LacZ小鼠的Eosin反染肝切片显示LacZ（+）胆管细胞（D）。在具有代表性的GFAP-Cre/LacZ小鼠（E）中，肝外胆管、胆囊管和胆囊显示出β-半乳糖苷酶活性，但在Ctr小鼠（F）中没有。健康成年小鼠（G）和正常人肝脏（H）的典型样本中的胆管细胞也表达GFAP。原代大鼠胆管细胞（Chol）和HSC表达GFAP mRNA，而原代肝细胞（Hep）不表达（I）。（X63）
图3
图3。MCDE饮食对血清肝酶水平、肝胶原Iα1 mRNA和肝质量的影响
在对照组（CON）、喂食MCDE饮食3周的小鼠（MCDE 3W）和喂食MCD饮食3周后恢复正常饮食3周（MCDE-恢复）的小鼠（n=4只小鼠/组/时间点）中测定血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）（A）和总胆红素（TB）（B）水平。使用实时PCR（C）评估同一小鼠肝脏样本中胶原蛋白Iα1mRNA的表达。（D） 对照组和两个MCDE饮食喂养组的肝脏重量（与对照组小鼠相比，*P<0.05，n=4只小鼠/组/时间点）。
图4
图4。GFP在TG小鼠肝脏损伤后的表达
给GFAP-Cre/GFP小鼠（n=15）喂食MCDE，1周（n=4）或3周（n=4）后处死幸存者。在MCDE治疗3周后存活的其他小鼠（n=4）在恢复正常饮食3周后处死。免疫组化检测GFP的表达。在1周MCDE饮食治疗（A，B）结束时、3周MCDE-饮食治疗（C，D）结束时或停止3周MDCE饮食治疗（E，F）后3周处死的小鼠的代表性结果。在X40处可见的GFP阳性细胞的数量在肝小叶的不同部位（即靠近中央静脉（CV）和门静脉束（PT））（G）进行计数p 0.05，**p<0.005（A、C、E原始放大倍数X10；B、D、F X63）。箭头和箭头分别表示入口三元组和中央静脉。
图5
图5。Ki-67在TG小鼠肝脏中的表达
给GFAP-Cre/GFP小鼠（n=15）喂食MCDE-diets，并如上所述处死幸存者（n=4/组/时间点）。进行Ki-67免疫组化或Ki-67/αSMA双重免疫组化。在X63（高倍）下观察到的Ki-67阳性细胞的数量在肝小叶的不同部分（即，近中央静脉（CV）和门静脉（PT））和不同的细胞类型（即，肝细胞（Hep）、胆管细胞（BD）和菊糖膜周衬细胞（Sinu））中进行计数。结果以（A）中阳性细胞/场的数量绘制。*在1周MCDE治疗结束时处死的小鼠中，Ki-67表达（B）和Ki-67及αSMA共同表达（C）p<0.05。在不同时间点统计肝小叶不同区域（CV或PT）Ki-67和αSMA的双阳性（DP）细胞数，结果如（D）所示。*p<0.05，**p<0.005（A，C放大倍率X100）
图6
图6。肝损伤后TG小鼠肝脏中GFP与αSMA、AE1/3或白蛋白的共表达
给GFAP-Cre/GFP小鼠（n=15）喂食MCDE-diets，并如上所述处死幸存者（n=4/组/时间点）。1周MCDE饮食组GFP和αSMA（A–B）或AE1/3（D）的双重免疫组化。在不同时间点统计不同区域GFP和αSMA的双阳性（DP）细胞数，结果如（C）所示。*p<0.05，**p<0.005。对GFP（E）、白蛋白（F）和一张合并的显微照片进行联合训练，以证明这些标记物（G）在一只从MCDE-diet转换为正常饮食的代表性小鼠中的联合表达，为期3周。（A、B、D X100；E–G原始放大倍数X63）
图7
图7。GFAP-cre/GFP小鼠HSC中GFP的表达
通过新鲜分离和5天培养激活的成年小鼠原代HSC分析基因表达。采用实时RT-PCR评估GFAP（A）、PPARγ（B）、水通道蛋白-1（AQP）（C）、CK-19（D）、MPK（E）、NCAM（F）、CK-7（G）、AFP（H）、α-SMA（I）、I型胶原α1（J）、S100A4（K）和GFP（L）mRNA水平。CK-7、αSMA和GFAP（M）的Western blot分析。HSC培养物在第0天（N）和第5天（O）用抗GFP抗体染色。（原始放大倍数X63，*p<0.05 vs第0天）
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