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.2008年7月3日；454(7200):126-30.
doi:10.1038/nature06992。 Epub 2008年5月28日。

诱导的ncRNAs变构修饰顺式RNA结合蛋白以抑制转录

王祥婷 1, Shigeki Arai公司, 宋晓源, 唐娜·雷查特, Kun Du公司, 加布里埃尔·帕斯科尔, 保罗·坦普斯特, 迈克尔·罗森菲尔德, 克里斯托弗·格拉斯, Riki Kurokawa先生
附属公司

诱导的ncRNAs变构修饰顺式RNA结合蛋白以抑制转录

王祥婷等。 自然. .

摘要

随着最近对许多基因侧翼的非编码RNA（ncRNAs）的认识，一个中心问题是充分了解它们在调节基因转录程序中的潜在作用，可能通过不同的机制。在这里，我们显示了一种RNA-结合蛋白，TLS（脂肪肉瘤中的易位蛋白），作为DNA损伤信号的关键转录调控传感器，其在RNA变构调节的基础上，特异性结合并抑制抑制基因靶点上的CREB-结合蛋白（CBP）和p300组蛋白乙酰转移酶活性，人类细胞系中的细胞周期蛋白D1（CCND1）。TLS对CCND1启动子的招募导致基因特异性抑制是由连接到CCND1 5'调控区的单链低拷贝ncRNA转录物引导的，CCND1调控区是对DNA损伤信号的响应。我们的数据表明，定位于转录单位调节区的信号诱导的ncRNAs可以作为选择性配体协同作用，招募和调节不同类别的RNA-binding共同调节器对特定信号的反应，提供了一种意外的基于ncRNA/RNA-结合蛋白的策略来整合转录程序。

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数字

图1
图1。TLS是一种特殊的CBP/p300 HAT抑制剂
一，通过“下拉”HAT测定法测定CBP-HAT活性。WCE，全细胞提取物；NE，核提取物；细胞、细胞质提取物。b、 顶部凝胶过滤色谱显示CBP HAT抑制活性。MW，分子量。底部Western blotting（WB）检测到TLS图谱。c（c），混合高、低MW馏分的代表性银色凝胶。d日TLS与CBP、p300和TIP60相互作用，但不与p/CAF相互作用。e（电子）GST-TLS对组蛋白或p53的CBP HAT活性的影响。
图2
图2。含有GGUG的RNA寡核苷酸促进TLS对CBP/p300 HAT活性的抑制作用
一RNase A处理的HeLa细胞p300和TLS的共免疫沉淀（IP）。b、 在GGUG-或CCUC-寡核苷酸存在下，使用微球菌核酸酶（MNase）或DNase I预处理的GST和GST-TLS测定P300 HAT活性。*与GST相比，p<0.02，n=3。c、 d，在GGUG-或CCUC-寡核苷酸存在下TLS N（1-211）：c（373-526）末端（c）或GST-TLS:p300（d）的相互作用。GST和GST-TLS用RNase A预处理。误差条显示±SEM。
图3
图3。TLS负调节CBP/p300 HAT调节CCND1号机组基因
一,CCND1号机组用forskolin（Forsk）和TLS公司小干扰RNA。CTL，控制。b、 c（c）组蛋白乙酰化（AceH3-K9K14）的染色质IP（ChIP）CCND1号机组发起人(b条)以及CCND1号机组基因表达(c（c）)在控制之下或美国海关与边境保护局和300页siRNA（siCBP/p300）。*p<0.01，n=3。d日，ChIP，带有指示的免疫球蛋白G（IgG）CCND1号机组forskolin处理后的启动子。MDM2型，控制。*p<0.01，n=3。e（电子），AceH3的ChIPCCND1号机组启动子存在对照或TLS siRNA。*p<0.01，n=3。误差线表示±SEM。
图4
图4。核糖核酸CCND1号机组s主要是与TLS结合的单链DNA结合物种
a、 顶部，ncRNA图CCND1号机组检测引物。底部、ncRNA的表达水平CCND1号机组s.IR，电离辐射；RT，逆转录酶。*p<0.01，**p<0.002，n=6。b条TLS的IP和RT-real-time PCR检测相关RNA。D、 非编码RNACCND1号机组_D类；5′UTR，5′UTR/CCND1；tRNA，tRNA14TyrATA。*p<0.01，n=3。c（c）ncRNA上TLS的ChIPCCND1号机组-“表达”（E、D和AB）和“非受压”区域（F和C）。*p<0.05，**p<0.01，n=3。d日，ncRNA的亚细胞分析CCND1号机组_D。e（电子）、ncRNA的拷贝数CCND1号机组_D。（f）、ncRNA的表达水平CCND1号机组_D根据指示的核糖核酸酶处理。*与对照组相比，p<0.05，**p<0.001，n=3。克TLS与RNA、互补DNA或RNA相互作用的凝胶位移分析：DNA杂交（R:D）。RNA，-454s来源于ncRNACCND1号机组_B。小时上TLS的ChIPCCND1号机组启动子基于指定的核糖核酸酶处理。*与CTL相比，p<0.01，n=3。误差线表示±SEM。
图5
图5。NcRNACCND1号机组负调节CCND1号机组通过将TLS招募到CCND1号机组发起人
一，的表达水平CCND1和CCNE1存在靶向ncRNA的siRNACCND1号机组_A（siA）、_D（siD）、_E（siE）或这些siRNA的共转染（siADE），或靶向CCND1号机组编码区(siCCND1型). * 与对照siRNA相比，p<0.01，n=6。b条TLS的ChIP和上的p300CCND1号机组在IR上，在siA或siD存在的情况下启动子。c（c），RNA寡核苷酸测试TLS结合和p300 HAT抑制。d日，AceH3的ChIPCCND1号机组启动子存在指定的siRNA。*p<0.05，n=3。e（电子），型号。误差线表示±SEM。
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