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.2008年5月；6(5):795-807.
doi:10.158/1541-7786.MCR-07-2097。

中性鞘磷脂酶-3是一种DNA损伤和非基因毒性应激调节基因，在人类恶性肿瘤中被解除调控

乍得A科克兰 1, 秦河, 苏里扬·波努萨米, 贝西姆·奥格特曼, 黄颖（音）, M Saeed Sheikh先生
附属机构

中性鞘磷脂酶-3是一种DNA损伤和非基因毒性应激调节基因，在人类恶性肿瘤中被解除调控

乍得A科克兰等。 Mol Cancer研究. 2008年5月.

摘要

在这项研究中，我们报道了一个新的基因毒性和非基因毒性应激调节基因的特征，我们之前将其命名为SKNY。我们的结果表明，SKNY编码最近鉴定的中性鞘磷脂酶-3（nSMase3；以下将SKNY称为nSMase3）。对nSMase3亚细胞分布的检测显示，nSMase 3定位于内质网（ER），并且含有其假定跨膜结构域和ER靶向信号的COOH末端区域的缺失部分改变了其对内质网的划分。基因毒性阿霉素和非基因毒性肿瘤坏死因子α治疗上调内源性nSMase3表达，尽管动力学不同。肿瘤坏死因子α在2小时内上调nSMase3的表达，并持续24小时以上，到36小时下降到控制水平。阿霉素对nSMase3的上调是短暂的，在30分钟内发生，到120分钟下降到控制水平。然而，阿霉素治疗延长24小时及以上，导致nSMase3表达下调。野生型p53的激活也下调了nSMase3的表达，这表明DNA损伤介导的nSMase 3下调似乎部分是通过肿瘤抑制剂p53实现的。外源性nSMase3的过度表达使细胞对阿霉素诱导的细胞杀伤敏感，这一发现与nSMase酶和nSMase-生成的神经酰胺的促凋亡作用相一致。我们进一步研究了nSMase3在各种人类恶性肿瘤中的表达，并发现其在几种原发性肿瘤的表达与相应的正常组织相比被解除了调控。总之，我们的结果已确定nSMase3是一种与肿瘤发生和细胞应激反应相关的重要分子。

PubMed免责声明

利益冲突声明

潜在利益冲突的披露

没有披露潜在的利益冲突。

数字

图1
图1。nSMase3蛋白序列和nSMase功能基序示意图
A类.人类nSMase3的氨基酸序列。预测的富含脯氨酸（242-264）区域下划线。与镁有关的假定谷氨酸（Glu316）2+绑定用星号表示。预测的跨膜跨膜区（819–857）以粗体字母表示，预测的KKXX-like ER滞留信号KLHQ（862–865）以斜体表示。B类.假定nSMase3域的示意图；为了进行比较，还显示了已知nSMase1和nSMase2域的示意图。
图2
图2。GFP标记的nSMase3的亚细胞分布
A类。nSMase3全长和突变/缺失结构的示意图。数字表示与假定功能域相对应的氨基酸残基。WT nSMase3中预测的KKXX-like信号（KLHQ）以及nSMase 3中这些残基变为丙氨酸(Poly-ala公司)装箱。B类使用抗GFP抗体进行Western blotting检测GFP和GFP-nSMase3的表达。然后对β-肌动蛋白进行相同的印迹，以显示相同的蛋白质负载量。CHeLa细胞与携带GFP或GFP-nSMase3的表达载体共同转染，pDsRed2-ER使用Lipofectamine 2000。细胞用PBS洗涤，用4%多聚甲醛固定，并用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚孵育(DAPI公司)染色细胞核。用Olympus AX70荧光显微镜分析细胞，并用数码相机拍摄照片。转染GFP的细胞的显微照片与转染GFPnSMase3表达载体的细胞没有比例。
图3
图3。TNF-α和DNA损伤剂调节nSMase3 mRNA表达
A类一个代表性的Northern杂交显示TNF-α处理对HT29细胞内源性nSMase3 mRNA水平的影响。细胞未经处理或用50 ng/mL TNF-α处理2、4、8、12、24、36或48小时。COX-2，环氧合酶-2。B类一个代表性的Northern印迹显示短期阿霉素治疗对RKO细胞内源性nSMase3 mRNA水平的影响。细胞未经处理或用1µmol/L阿霉素处理30、60、90或120分钟。C中描述的nSMase3级别的图形表示B类通过将nSMase3 mRNA标准化为18S rRNA来测定nSMase3mRNA的相对水平。D类一个代表性的Northern印迹显示长期阿霉素治疗对内源性nSMase3 mRNA水平的影响。细胞未经处理或用0.50µmol/L（RKO）、1µmol/L（DLD1）或5µmool/L（HT29）阿霉素处理12、24、36或48小时。A类,B类、和D类获取总RNA，然后按照材料和方法中的描述进行Northern blot分析。用32P标记的nSMase3和环氧合酶-2或p21探针；28S和18S rRNA的溴化乙锭染色也显示了负载和RNA完整性。
图4
图4。p53下调nSMase3
一个代表性的Northern印迹显示可诱导WT p53对DLD1细胞内源性nSMase3 mRNA水平的影响。在存在（p53被抑制）或不存在（p53-induced）40 ng/mL强力霉素的情况下生长的细胞(Dox公司)按照材料和方法中的描述，在指定的时间段内采集、提取RNA并进行Northern blot分析。用32P标记的nSMase3和p21WAF1（加权平均1）探针；28S和18S rRNA的溴化乙锭染色也显示RNA负载和完整性。
图5
图5。nSMase3使细胞对DNA损伤诱导的凋亡敏感
A类一个代表性的Western blot显示外源性Myc-tagged nSMase3在DLD1或RKO细胞中稳定表达。收集汇集的载体（pcDNA3.1-Myc）转染子和稳定表达外源nSMase3的分离的克隆（pcDNA3.1-Myc-nSMase3），并进行SDS-PAGE。使用抗Myc抗体进行蛋白质印迹。然后对β-肌动蛋白进行相同的印迹，以显示相同的蛋白质负载量。B类RKO和DLD1载体以及两个独立稳定克隆（分别命名为55和61，以及7和35）中的nSMase3稳定细胞系的膜组分。C和D类用20 nmol/L（RKO）或40 nmol/L（DLD1）的阿霉素处理载体和nSMase3稳定细胞系24或48小时，并按照材料和方法中的描述评估克隆存活率。RKO的代表性板材(C)和DLD1(D类)实验结果表明。电子.DLD1矢量(○) 和nSMase3-克隆7(●) 和nSMase3-克隆35(■) 用200 nmol/L阿霉素连续处理稳定的转染体48、72或96小时，并按照材料和方法中的描述进行3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵细胞活力测定。实验一式三份。分数，平均三倍；巴，东南。
图6
图6。nSMase3在匹配的正常和肿瘤样本中有差异表达
A类代表性Northern杂交显示乳腺癌、前列腺癌、结肠癌和肺癌细胞系中nSMase3表达。用探针探测斑点32P标记的nSMase3探针；28S和18S rRNA的溴化乙锭染色也显示了负载和RNA完整性。JCA-1细胞以前被认为是前列腺癌细胞；现在，他们被认为代表膀胱癌。B类和C.包含来自肿瘤的标准化cDNA的癌症分析阵列(T型)和相应的法线(N个)如材料和方法中所述，使用nSMase3探针探测单个患者的组织样本。*，匹配对显示肿瘤中nSMase3 mRNA水平高于匹配的正常组织样本；**，匹配对显示肿瘤中nSMase3 mRNA水平低于匹配的正常组织样本。
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