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。2008年5月21日；3（5）：e2233。
doi:10.1371/journal.pone.0002233。

从CD4（pos）CD25（high）T细胞体外生成人同种异体抗原特异性调节性T细胞用于免疫治疗

乔里克·彼得斯 1, 卢克B希尔布兰德, 汉斯·J·P·M·科恩, 伊尔玛·乔斯顿
附属公司

从CD4（pos）CD25（high）T细胞体外生成人同种异体抗原特异性调节性T细胞用于免疫治疗

乔里克·彼得斯等。 公共科学图书馆一号。 。

摘要

背景：基于调节性T细胞（Treg）的免疫治疗是几种免疫疾病的潜在治疗方法。到目前为止，这种方法在临床前动物移植和自体免疫模型中被证明是成功的。在这些模型中，基于Treg的免疫治疗的成功关键取决于注入Treg人群的抗原特异性。对于人类环境，缺乏关于如何在体外产生具有直接抗原特异性的Treg以用于免疫治疗的信息。

方法/主要发现：在这里，我们证明，在使用HLA不匹配的异基因刺激细胞和T细胞生长因子的两个刺激周期内，磁珠分离的人类CD4（pos）CD25（high）Treg中达到了非常高的异抗原特异性。细胞数量得到有效增加。初次同种异体刺激似乎是产生同种异体抗原特异性Treg的先决条件，而用抗CD3加抗CD28单克隆抗体进行的二次同种异体或多克隆刺激在类似程度上富集了同种异体抗原特异性和细胞产量。

结论/意义：我们所描述的离体扩增方案很可能会提高基于Treg的临床免疫疗法的成功率，并有助于诱导对选定抗原的耐受性，同时最大限度地减少一般免疫抑制。这种方法对HLA不匹配移植的受者特别感兴趣。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：提交人声明不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。扩张战略的示意图概述。
Treg在两个周期内扩增，在这两个周期中，同种异体抗原和多克隆刺激交替进行，导致四种不同的策略：两个后续周期的同种异体蛋白刺激；异抗原刺激的初级周期和多克隆刺激的次级周期；多克隆刺激的初级周期和同种异体抗原刺激的次级周期；以及随后的两个多克隆刺激周期。
图2
图2。新鲜MACS分离Treg的表型和功能特征。
CD4细胞销售时点情报系统从PBMC中阴性分离T细胞，并将其分离为CD25销售时点情报系统（Treg）和CD25否定（Tconv）通过磁性细胞分类的T细胞组分。显示了典型隔离的数据。（A） 在Treg（黑色填充直方图）或Tconv（灰色线直方图”）上分析CD25、CD127、CD27、CD70和CD62L的细胞表面表达以及FoxP3的细胞内表达。（B） 在缺乏（黑条）或存在（灰条）外源性IL-2的情况下，用HLA不匹配γ射线照射的异基因PBMC刺激Treg或Tconv后，测定其增殖能力。扩散通过测量[三H] 第5天胸腺嘧啶掺入。（C） 在MLR共培养中使用[三H] 胸腺嘧啶掺入。自体幼稚CD4销售时点情报系统CD25细胞否定用HLA不匹配γ射线照射的异基因PBMC刺激Tresp细胞。将Treg（黑线）或Tconv（灰线）按指示的Tresp∶Treg/Tconv比率添加到这些培养物中。扩散通过测量[三H] 第5天胸腺嘧啶掺入。结果以百分比表示[三H] 胸腺嘧啶掺入+SD，索引为[三H] 胸腺嘧啶仅掺入幼稚Tresp和抗原。（D） 使用CFSE稀释法在MLR共培养中测定Treg对同种异体抗原反应的抑制能力。CFSE标记的自体原始CD4销售时点情报系统CD25细胞否定用PKH26标记的HLA不匹配γ射线照射的异基因PBMC刺激Tresp细胞。将Treg（黑线）或Tconv（灰线）以指示的Tresp∶Treg/Tconv比值加入这些培养物中。通过在第5天测量Tresp的CFSE稀释度来测定增殖。结果以增殖细胞的百分比表示，与单纯Tresp和抗原培养物中增殖细胞的百分数相关。（E） 抑制试验的CFSE示例如图2D所示。仅显示Tresp（灰色填充直方图）、Tresp+Treg（1∶1，黑线）和Tresp+Tconv（1∶1，灰色线），数字表示增殖细胞的百分比，指数为仅幼稚Tresp和抗原培养物中增殖细胞的百分比。
图3
图3。同种抗原Treg刺激最佳强度的测定。
（A） 在存在IL-2和IL-15的情况下，用指示比例的辐照异基因PBMC刺激Treg。通过测量[三H] 第5天胸腺嘧啶掺入。数据是三个独立实验的代表。（B） 在IL-2和IL-15存在的情况下，用同种抗原激发的Treg按照照射后的同种PBMC的指示比例进行再刺激。通过测量[三H] 第3天掺入胸苷。数据是三个独立实验的代表。（C） 主要同种异体抗原刺激的扩增效率与HLA-DRB1错配的数量有关。在存在IL-2和IL-15的情况下，在一个周期内扩增新分离的Treg，并用一个（N=10）或两个（N=6）HLA II类DRB1基因失配的γ射线照射异基因PBMC刺激。通过将初始培养物中建立的细胞数量与膨胀后（休息两天后）的细胞数量相关联，计算膨胀值。两个HLA-DRB1基因上的同种异体抗原错配与一个错配的同种异源抗原相比，扩增更高。在Mann-Whitney检验中发现这种差异具有统计学意义（P=0.025）。
图4
图4。确定初级多克隆Treg刺激的最佳模式和强度。
（A） 用指定比例的抗CD3+抗CD28微球刺激Treg，或在IL-2和IL-15存在的情况下，用指定浓度的平板结合的抗CD3+可溶性抗CD28（1μg/ml）刺激。通过测量[三H] 第4天胸腺嘧啶掺入。（B） 使用最佳强度的抗CD3+抗CD28微球（设置为100%）或平板结合抗CD3加可溶性抗CD28刺激原代多克隆Treg培养后的指标细胞产量。（C） 不同初级多克隆刺激后Treg的细胞分裂模式和存活/死亡信号。Treg用CFSE染色，并用最佳强度的抗CD3+抗CD28微球或平板结合的抗CD2+可溶性抗CD28刺激。在第4天评估Treg人群的CFSE稀释模式、7AAD染色和Bcl-2表达。在最下面的一行中，Bcl-2表达仅在划分Treg上进行描述。数据是四个独立实验的代表。
图5
图5。二次多克隆Treg刺激的最佳模式和强度的确定。
（A） 用抗CD3+抗CD28微球对Treg进行引物，并在IL-2和IL-15存在的情况下，用指定比例的抗CD3+-抗CD28微珠或指定浓度的平板结合的抗CD2+可溶性抗CD28重新刺激Treg。通过测量[三H] 第3天胸腺嘧啶掺入。（B） 使用最佳强度的抗CD3+抗CD28微球（设置为100%）或平板结合的抗CD3+可溶性抗CD28刺激进行二次多克隆Treg培养后的细胞产量指标。（C） 不同次级多克隆刺激后Treg的细胞分裂模式和存活/死亡信号。Treg用CFSE染色，并用最佳强度的抗CD3+抗CD28微珠或板结合的抗CD3+可溶性抗CD28刺激。在第4天评估Treg群体的CFSE稀释模式、7AAD染色和Bcl-2表达。数据是四个独立实验的代表。
图6
图6。确定一次和二次Treg膨胀循环的最佳长度。
（A） 主Treg膨胀循环的最佳长度。在存在IL-2和IL-15的情况下，用CFSE标记的同种抗原（实线，实线圈）或多克隆（虚线，开圈）刺激刺激Treg。在指定的时间点，由FACS统计Treg数量（不包括CFSE销售时点情报系统异基因刺激细胞）并且与初始建立时的Treg数量相关。（B） 次级Treg膨胀循环的最佳长度。如IL-2和IL-15所示，用同种抗原（实线）或多克隆（虚线）刺激激发Treg，并在重新刺激前休息2天。在存在IL-2和IL-15的情况下，用CFSE标记的同种抗原（实心圈）或多克隆刺激物（开放圈）重新刺激细胞。在指定的时间点，由FACS统计Treg数量（不包括CFSE销售时点情报系统异基因刺激细胞），并与初始设置时的Treg数相关。数据是三个独立实验的代表。
图7
图7。用交替的同种异体抗原或多克隆刺激进行初级和次级周期后的Treg扩增。
Treg和Tconv根据图1中的时间表进行了扩展，并休息了两天。确定了Treg编号，并与初始设置时的Treg数量相关。数据表示七个独立实验的平均扩展+SD。
图8
图8。扩展Treg的表型特征。
Treg和Tconv根据图1中的时间表进行了扩展，并休息了两天。在Treg（黑色填充直方图）或Tconv（灰色线直方图。数据代表了四到七个独立实验。
图9
图9。扩张Treg的增殖能力。
Treg和Tconv根据图1中的时间表进行了扩展，并休息了两天。在无IL-2（黑条）或有IL-2（灰条）的情况下，用目标同种异体抗原（与用于扩增的相同）重新刺激扩增细胞后，测定扩增细胞的增殖能力。扩散通过测量[三H] 第3天胸腺嘧啶掺入。结果以百分比表示[三H] 胸苷掺入+SD。数据代表了四个独立实验。
图10
图10。膨胀Treg的抑制能力[三H] 胸腺嘧啶掺入抑制试验。
Treg和Tconv根据图1中的时间表进行了扩展，并休息了两天。（A） 在MLR共培养中测定Treg对靶抗原和第三方抗原应答的抑制能力，使用[三H] 胸腺嘧啶掺入。自体幼稚CD4销售时点情报系统CD25细胞否定用目标同种抗原（与扩增用抗原相同）或第三方HLA不匹配γ射线照射的异基因PBMC刺激Tresp细胞。将扩增的Treg（黑线）或Tconv（灰线）以指示的Tresp∶Treg/Tconv比率添加到这些培养物中。扩散通过测量[三H] 第5天胸腺嘧啶掺入。结果以百分比表示[三H] 胸腺嘧啶掺入+SD，索引为[三H] 胸腺嘧啶仅掺入幼稚Tresp和抗原。数据是七个独立实验的代表。（B） 使用CFSE稀释法在MLR共培养中测定Treg对靶异体抗原和第三方异体抗原反应的抑制能力。CFSE标记的自体幼稚CD4销售时点情报系统CD25细胞否定用PKH26标记的靶抗原（用于扩增）或PKH26标签的第三方HLA错配γ射线照射的异基因PBMC刺激Tresp细胞。将扩增的Treg（黑线）或Tconv（灰线）以指示的Tresp∶Treg/Tconv比率添加到这些培养物中。通过在第5天测量Tresp的CFSE稀释度来测定增殖。结果以增殖细胞的百分比表示，与单纯Tresp和抗原培养物中增殖细胞的百分数相关。数据是三个独立实验的代表。
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