Akt-mediated eminent expression of c-FLIP and Mcl-1 confers acquired resistance to TRAIL-induced cytotoxicity to lung cancer cells

doi:10.1158/1535-7163.MCT-07-2183

.2008年5月；7(5):1156-63.

doi:10.1158/1535-7163.MCT-07-2183。

Akt介导的c-FLIP和Mcl-1高表达增强了对TRAIL诱导的肺癌细胞毒性的获得性抵抗

王霞（Xia Wang）¹, 陈文殊, 曾伟华, 郎白, 约汉内斯·特斯法齐（Yohannes Tesfaigzi）, 史蒂文·贝林斯基, 永林

附属公司

PMID： 18483303
预防性维修识别码：下午2715176
内政部： 10.1158/1535-7163.MCT-07-2183

Akt介导的c-FLIP和Mcl-1高表达增强了对TRAIL诱导的肺癌细胞毒性的获得性抵抗

王霞等。摩尔癌症治疗. 2008年5月.

.2008年5月；7(5):1156-63.

doi:10.1158/1535-7163.MCT-07-2183。

作者

王霞（Xia Wang）¹, 陈文殊, 曾伟华, 郎白, 约汉内斯·特斯法齐（Yohannes Tesfaigzi）, 史蒂文·贝林斯基, 永林

附属

¹Lovelace呼吸研究所分子生物学和肺癌项目，地址：2425 Ridgecrest Drive Southeast，Albuquerque，NM 87108，USA。

PMID： 18483303
预防性维修识别码： PMC2715176型
内政部： 10.1158/1535-7163.MCT-07-2183

摘要

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）对转化细胞具有选择性杀伤作用，是一种潜在的抗癌药物。然而，TRAIL也可以刺激TRAIL耐药癌细胞的增殖和转移。因此，在TRAIL治疗期间获得的TRAIL抵抗将使患者的治疗从有益转向有害。在本研究中，我们重点关注获得性TRAIL耐药机制，并表明抗凋亡因子细胞FLICE-like抑制蛋白（c-FLIP）和前生存Bcl-2家族成员髓系细胞白血病-1（Mcl-1）的高表达是肺癌细胞中此类TRAIL耐药的主要机制。长期接触TRAIL导致肺癌细胞对TRAIL诱导的细胞毒性产生耐药性，这种耐药性与c-FLIP（L）和Mcl-1（L）的细胞水平增加有关。c-FLIP（L）的过度表达抑制了caspase-8向死亡诱导信号复合体的募集，而Mcl-1（L）表达的增加减弱了线粒体凋亡途径。c-FLIP（L）和Mcl-1（L）表达的增加是由于Akt介导的这些蛋白在TRAIL耐药细胞中的稳定。重要的是，通过RNA干扰抑制c-FLIP（L）和Mcl-1（L）的表达共同缓解了获得性TRAIL抵抗。综上所述，这些结果确定c-FLIP（L）和Mcl-1（L）是获得性TRAIL耐药的主要决定因素，并可能成为提高TRAIL治疗肺癌价值的分子靶点。

PubMed免责声明

数字

**图1。慢性TRAIL暴露诱导H460肺癌细胞获得性抵抗TRAIL诱导的细胞毒性**
A类用指示浓度的TRAIL处理H460和H460-TR细胞24小时。通过LDH释放试验测量细胞死亡。柱，三个实验的平均值；巴，标准偏差。B类，H460和H460-TR细胞用80ng/mL TRAIL处理所指示的时间。用针对这些蛋白的特异性抗体通过Western blot检测Caspase-8、Bid、Caspase-3和PARP。β-actin被检测为输入对照。

**图2。增加c-FLIP_我H460-TR细胞中caspase-8的表达及抑制其向DISC的募集**
A类用蛋白特异性抗体免疫印迹法检测H460和H460-TR细胞中DISC组分的表达。β-actin被检测为输入对照。B类，通过GST下拉分析检测DISC形成。用1μg/mL GST-TRAIL处理H460和H460-TR细胞20分钟或不处理。细胞在M2缓冲液中溶解。将GST-TRAIL（1μg/mL）添加到来自未刺激细胞的裂解物中，以沉淀未刺激的TRAIL受体。通过Western blot分析GST-TRAIL结合蛋白复合物中是否存在DR5、FADD、caspase-8和c-FLIP，非特异性带。

**图3。增加c-FLIP的蛋白质稳定性_我H460-TR电池**
A类，H460-TR细胞用10μg/mL环己酰亚胺（CHX）或10μM MG132或两者处理4小时c-FLIP_我Western blot检测。β-actin被检测为输入对照。B类用10μg/mL CHX处理H460和H460-TR细胞指定时间。c-FLIP公司_我Western blot检测蛋白。β-actin被检测为输入对照。C，c-FLIP表达结果，如面板所示B类定量，并归一化为β-actin。

**图4。增加的Mcl-1_我H460-TR细胞线粒体凋亡途径的表达及抑制**
A类Western blot分析检测Bcl-2家族和IAP家族蛋白在H460和H460-TR细胞中的表达。β-actin被检测为输入对照。B类用80 ng/mL TRAIL处理H460和H460-TR细胞达指定时间。检测细胞提取物的细胞溶质部分的细胞色素C（上面板）。通过Western blot检测TRAIL处理（80 ng/ml）H460和H460-TR细胞的总细胞提取物中的caspase-9。C，H460-TR细胞用10μg/mL环己酰亚胺（CHX）或10μM MG132或两者处理4小时。Mcl-1_我Western blot检测蛋白。β-actin被检测为输入对照。D类，H460和H460-TR细胞用10μg/mL CHX处理指定的时间。Mcl-1型_我蛋白质经Western blot分析。检测到β-肌动蛋白作为输入对照（上图）。Mcl-1的结果_我定量表达并归一化为β-actin（下面板）。

**图5。抑制c-FLIP_我和Mcl-1_我H460-TR细胞表达减轻获得性TRAIL抵抗**
A类H460-TR细胞未经处理或用10μg/mL环己酰亚胺（CHX）处理30分钟，然后用80 ng/mL TRAIL处理24小时。通过LDH分析测定细胞死亡。柱，三个实验的平均值；巴，标准偏差。B类，H460-TR细胞转染Mcl-1 siRNA、c-FLIP siRNA或两者。Mcl-1型_我和c-FLIP_我转染30 h后用Western blot检测。未转染、模拟或阴性siRNA-转染细胞也显示为对照。C，用指示的siRNA转染H460-TR细胞。转染后30小时，用80 ng/mL TRAIL再处理细胞24小时，检测细胞死亡，如A所述。

**图6。Akt活性升高有助于Mcl-1的稳定_我和c-FLIP_我**
A类Western blot检测H460和H460-TR细胞中磷酸化Akt（p-Akt）和总Akt。β-actin被检测为输入对照。B类用10μM LY294002处理H460-TR细胞过夜。Mcl-1型_我，c-FLIP_我Western blot检测p-Akt。β-actin被检测为输入对照。C使用针对Akt1、Akt2和Akt3的混合siRNA敲除H460-TR细胞中的Akt。p-Akt、总Akt和Mcl-1_我和c-FLIP_我Western blot检测。D类，未转染的、模拟的和阴性siRNA转染的细胞显示为H460-TR细胞。对照细胞用80 ng/mL TRAIL处理24 h，通过LDH分析检测细胞死亡。柱，三个实验的平均值；条，SD。

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