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.2008年5月；14(5):661-73.
doi:10.1016/j.devcel.2008.02.004。

葡萄糖限制通过AMPK介导的Nampt调节激活SIRT1抑制骨骼肌成肌细胞分化

马塞拉·富尔科 1, 亚娜·岑, 赵波, 埃里克·P·霍夫曼, 迈克尔·麦克伯尼, 安东尼·阿索夫, 维托里奥·萨托雷利
附属公司

葡萄糖限制通过AMPK介导的Nampt调节激活SIRT1抑制骨骼肌成肌细胞分化

马塞拉·富尔科等。 开发人员单元格. 2008年5月.

摘要

可以直观地推测，营养物质的可用性可能会影响哺乳动物细胞的分化。尽管如此，这一过程中涉及的分子决定因素的全面补充尚未阐明。在这里，我们研究了营养素（葡萄糖）如何影响骨骼肌发生。葡萄糖限制（GR）损害骨骼肌成肌细胞的分化，并与AMP活化蛋白激酶（AMPK）的激活有关。活化的AMPK需要促进GR诱导的NAD+生物合成酶Nampt的转录。事实上，GR增强了Nampt活性，从而改变了细胞内[NAD+]:[NADH]比率和烟酰胺水平，并介导了骨骼肌生成的抑制。来自SIRT1+/-杂合小鼠的骨骼肌成肌细胞对GR或AMPK激活的影响具有抵抗力。这些实验表明，AMPK、Nampt和SIRT1是功能性信号通路的分子组成部分，使骨骼肌细胞能够感知和反应营养物质的可用性。

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图1
图1
葡萄糖限制抑制骨骼肌成肌细胞分化并激活AMPK。（A） C2C12细胞在补充有25mM或5mM葡萄糖的培养基（分化培养基，DM）中分化48小时。用MHC抗体进行免疫荧光（IF）。DAPI标记细胞核。本研究中报告的融合指数按照实验程序进行测定（p<0.05）。（B） 根据（A）中培养的C2C12细胞的细胞提取物对MHC、小窝蛋白-3和微管蛋白进行免疫印迹。（C） 小鼠原代成肌细胞在含有25mM或0.5mM葡萄糖的DM中培养48小时。如（A）所示执行IF。（D） 在含有25mM或5mM葡萄糖的DM中培养的C2C12细胞的提取物中测定ATP水平。（E） 在含有25mM、5mM或2.5mM葡萄糖的DM中培养的C2C12细胞中，AMPK（pT172）和AMPK底物ACC（pS79）的磷酸化通过使用磷酸特异性AMPK和ACC抗体的免疫印迹测定。用AMPK和ACC抗体测定AMPK与ACC的总水平。（F） C2C12细胞暴露于AICAR（0.5mM），AMPK和ACC磷酸化如（E）所示。（G） C2C12细胞在含有25mM葡萄糖的DM中培养，并暴露于载体（DMSO）或AICAR（0.5mM）中36小时。使用MHC抗体进行IF。（H） （G）中所述细胞提取物的MHC和微管蛋白免疫印迹。（一） 用表达显性阴性AMPK（myc-tagged AMPK-DN）的逆转录病毒转导的C2C12细胞在补充25mM或5mM葡萄糖的DM中培养。使用MHC抗体进行IF。（J） 来源于（I）中所述细胞的提取物与MHC、myc和微管蛋白抗体的免疫印迹。（K） 暴露于AICAR（0.5mM）的表达myc-AMPK-DN的细胞提取物的MHC、myc和GAPDH免疫印迹。
图2
图2。SIRT1介导葡萄糖限制对骨骼肌成肌细胞的影响
（A） 用MHC、小窝蛋白-3和微管蛋白抗体对培养在含有25mM或5mM葡萄糖、不含或含有NAM（5mM）的DM中的C2C12细胞的提取物进行免疫印迹。（B） 用表达针对SIRT1（shSIRT1）的RNA发夹的逆转录病毒转导C2C12细胞，并在含有25mM、5mM或2.5mM葡萄糖的DM中培养。用抗MHC、SIRT1和微管蛋白的抗体进行免疫印迹。（C） 在含有25mM或5mM葡萄糖的DM中培养的表达对照或hSIRT1的细胞的MHC IF。（D） 来自4周龄野生型（WT）或SIRT1的新分离小鼠初级骨骼肌成肌细胞转录物（胚胎肌球蛋白重链Myh3、肌钙蛋白C2和SIRT1）的RT-qPCR+/−杂合小鼠在含有25mM或0.5mM葡萄糖的DM中培养。对三个独立获得的RNA样本进行了评估。针对GAPDH转录本，对每个转录本的值进行了校正。误差线代表标准偏差（p<0.05）。（E） WT和SIRT1的MHC IF+/−骨骼肌成肌细胞在含有25mM或0.5mM葡萄糖的DM中培养。（F） 从WT或SIRT1获得的小鼠原代成肌细胞提取物的SIRT1和微管蛋白免疫印迹+/−在25mM或0.5mM葡萄糖中培养的杂合动物。
图3
图3。AMPK激活可逆转葡萄糖限制的影响，并且是SIRT1依赖性的
（A） 表达shSIRT1的C2C12细胞提取物的MHC、SIRT1和微管蛋白免疫印迹，在25mM葡萄糖中培养，并暴露于浓度增加（0.25–0.5mM）的AICAR中36小时。（B，C）MHC IF（B）和（A）中所述细胞的肌生成素和Myh3转录物（C）。五、 二甲基亚砜；A、 AICAR公司。（D） WT或SIRT1小鼠原代骨骼肌成肌细胞的MHC-IF+/−杂合小鼠在含有DMSO（载体）或AICAR（0.5mM）的DM中培养36-48小时。
图4
图4。葡萄糖限制、AMPK激活或Nampt对[NAD的影响+]/骨骼肌细胞的[NADH]比率、SIRT1活性和烟酰胺（NAM）水平
（A） 分别在含有25mM或5mM葡萄糖的DM中培养24小时的C2C12细胞提取物中评估SIRT1活性。（B）[NAD+]/在含有25mM或5mM葡萄糖的DM中培养的C2C12细胞的提取物中测定[NADH]比率和（C）NAM水平。（D） 在暴露于载体或AICAR（0.5mM）24小时的C2C12细胞提取物中评估SIRT1活性。（E） [北美地区+]/在不存在（载体，V）或存在AICAR（A）的情况下，在含有25mM葡萄糖的DM中培养的C2C12细胞中评估[NADH]比率和（F）NAM水平。（G） SIRT1介导的脱乙酰化反应和NAD的示意图+抢救路径。（H） 在含有25mM或5mM葡萄糖的DM中培养的C2C12细胞提取物中的Nampt酶活性。（一） 在不含或含有AICAR（A）的情况下，在含有25mM葡萄糖的DM中培养的C2C12细胞提取物中的Nampt酶活性。（J） 表达针对Nampt（shNampt）的RNA发夹的C2C12细胞的Nampt和GAPDH免疫印迹。（K） [北美地区+]/在含有25mM或5mM葡萄糖的DM中培养的表达shNampt的细胞中的[NADH]比率。（五十） 对照组或表达shNampt的C2C12细胞的MHC IF在含有25mM或5mM葡萄糖的DM中培养。用三个独立的样品重复此图中报告的所有酶测量。误差线表示标准偏差。
图5
图5。AMPK激活对细胞分化的影响依赖于Nampt和SIRT1
（A） [北美地区+]/在含有25mM或5mM葡萄糖的DM中培养的Nampt抑制剂FK866（10nM）暴露于C2C12细胞中的[NADH]比率。（B） 暴露于FK866（10nM）的C2C12细胞提取物的MHC和微管蛋白免疫印迹。（C） C2C12细胞提取物的MHC、肌生成素、小窝蛋白-3和微管蛋白免疫印迹，暴露于浓度增加（0.25–0.5mM）的AICAR和FK866（10nM）在含有25mM葡萄糖的DM中。（D） 将C2C12细胞（对照组或shNampt）提取物暴露于含有25mM葡萄糖的DM中的AICAR后，进行MHC、肌生成素、小窝蛋白-3、Nampt和GAPDH免疫印迹。（E） 在含有25mM葡萄糖和0.5mM AICAR或载体的DM中培养的对照或表达shNampt的C2C12细胞的MHC IF。（F） 对照组或表达myc-Nampt的C2C12细胞在含有25mM葡萄糖的DM中培养的MHC-IF。（G） （F）中描述的C2C12细胞提取物的MHC、myc和微管蛋白免疫印迹。（H） 表达myc-Nampt的C2C12细胞提取物的MHC、SIRT1、myc和微管蛋白免疫印迹，并用对照（加扰）或SIRT1 siRNA转染。细胞在含有25mM葡萄糖的DM中培养。（I） 表达myc NNMT的C2C12细胞提取物的MHC、myc和微管蛋白免疫印迹，并在含有25mM葡萄糖的DM中培养。（J） 免疫印迹如（I）所述，使用在无或存在NAM（5mM）的情况下培养的对照或表达NNMT的C2C12细胞的提取物。
图6
图6。在体内SIRT1在禁食期间的作用
（A） WT和SIRT1后肢肌肉UCP-2、UCP-3、PDK4和CD36转录物的RT-qPCR−/−喂食老鼠随意（AL）或禁食48小时。针对GAPDH转录本，对每个转录本的值进行了校正。误差线表示标准偏差。分析每个实验组三只（n=3）动物的RNA。折叠诱导和p值显示在右侧面板中。（B） 喂食AL（1-2道）或禁食（F）48小时（3-4道）和SIRT1的WT小鼠后肢肌肉提取物的UCP-2、UCP-3和微管蛋白免疫印迹−/−小鼠喂食AL（5-6通道）或禁食（F）48小时（7-8通道）。来自两个WT和两个SIRT1的肌肉−/−对每种实验条件下的动物进行分析。（C） WT和SIRT1中胚胎Myh3和围产期Myh8以及非肌肉Myl6肌球蛋白转录物的RT-qPCR−/−老鼠。将每个转录物的值校正为GAPDH转录物的值。误差线表示标准偏差。分析每个实验组三只（n=3）动物的RNA。（D） WT和SIRT1后肢肌肉提取物的MHC围产期和微管蛋白免疫印迹−/−老鼠。两个WT和两个SIRT1−/−对动物进行了分析
图7
图7。AMPK介导葡萄糖限制诱导的Nampt转录
（A） 在含有25mM、5mM或2.5mM葡萄糖的DM中培养的C2C12细胞Nampt RNA转录物的RT-qPCR。在该图中报告的所有实验中，针对GAPDH转录本校正了Nampt值。误差线表示标准偏差。（B） 如（A）所述培养的C2C12细胞提取物的Nampt和GAPDH免疫印迹。（C） 小鼠（n=3）后肢肌肉Nampt RNA转录物的RT-qPCR，接受48小时禁食（F）或喂食AL。（D）暴露于含有25mM葡萄糖的DM中AICAR的C2C12细胞Nampt转录物。（E） 将C2C12细胞提取物暴露于含有25mM葡萄糖的DM中的AICAR，进行Nampt免疫印迹。通过扫描与Nampt信号相对应的频带并校正从GAPDH信号获得的值（Nampt/GAPDH比率）来进行量化。（F） 在含有25mM、5mM或2.5mM葡萄糖的DM中表达AMPK-DN的C2C12细胞提取物的Nampt和GAPDH免疫印迹。（G） 在含有25mM或5mM葡萄糖（H）的DM中培养的对照组或表达AMPK-DN的C2C12细胞提取物中的Nampt活性[NAD+]/在含有25mM或5mM葡萄糖的DM中培养的对照细胞或表达AMPK-DN的C2C12细胞的[NADH]比率。（I） CR-AMPK-Nampt-SIRT1通路的示意图。
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