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.2008年5月27日；47(21):5724-35.
doi:10.1021/bi800097h。 Epub 2008年5月6日。

大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中四种谷氨酰胺酶的功能和结构特征

雷格·布朗 1, 阿里克斯·辛格, 迈克尔·普劳德富特, 塔蒂亚娜·斯卡琳娜, 金永昌, 张昌秀, 伊琳娜·德蒙蒂耶娃, 叶卡捷琳娜·库兹涅佐娃, 克劳迪奥·冈萨雷斯, 安德烈·约阿奇米亚克, 阿列克谢·萨文琴科, 亚历山大·亚库宁
附属公司

大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中四种谷氨酰胺酶的功能和结构特征

雷格·布朗等。 生物化学. .

摘要

谷氨酰胺酶属于丝氨酸依赖性β-内酰胺酶和青霉素结合蛋白的大超家族，它们催化L-谷氨酰胺水解脱酰胺生成L-谷氨酸。在这项工作中，我们从大肠杆菌（YbaS和YneH）和枯草芽孢杆菌（YlaM和YbgJ）中纯化并生化表征了四种预测的谷氨酰胺酶。这些蛋白质对L-谷氨酰胺表现出严格的特异性，并且不会水解D-谷氨酰胺或L-天冬酰胺。在每种生物体中，一种谷氨酰胺酶对谷氨酰胺的亲和力（大肠杆菌YbaS和枯草芽孢杆菌YlaM；K m分别为7.3和7.6 mM）高于第二种谷氨酰胺酶类（大肠杆菌YeneH和枯草杆菌YbgJ；K m各自为27.6和30.6 mM）。大肠杆菌YbaS和枯草芽孢杆菌YbgJ的晶体结构表明存在经典的类β-内酰胺酶折叠，并保留了几种关键的β-内内酰胺酶催化残基（YbgJ中的Ser74、Lys77、Asn126、Lys268和Ser269）。丙氨酸置换突变表明，位于谷氨酰胺酶催化位点的大多数保守残基对活性至关重要。谷氨酰胺酶抑制剂6-重氮-5-氧代-l-去甲亮氨酸与YbgJ复合物的晶体结构显示抑制剂与Ser74的羟基氧之间存在共价键，提供证据证明Ser74是初级催化亲核试剂，谷氨酰胺酶反应通过形成酶-谷氨酰胺中间体进行。对大肠杆菌谷氨酰胺酶缺失菌株的生长实验表明，YneH作为碳和氮的唯一来源参与l-谷氨酰胺的同化，并表明谷氨酰胺酶（YbaS和YneH）也有助于大肠杆菌的耐酸性。

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数字

图1
图1
几种细菌和人类β-内酰胺酶样谷氨酰胺酶的结构序列比对。二级结构元素显示在路线的上方（YbaS）和下方（YbgJ）。高度保守的残留物被遮蔽并装箱。包含β-内酰胺酶特征基序I、II和III的残基用星号标记。比较的谷氨酰胺酶是大肠杆菌YbaS（P77454），大肠杆菌YneH（P0A6W0），黄体分枝杆菌GlsA（Q4U1A6），智人GlsK（O94925），智人GlsL（Q9UI32），菜豆根瘤菌GlsA（O87405），枯草杆菌YlaM（O07637），以及枯草杆菌YbgJ（O31465）。
图2
图2
谷氨酰胺酶的晶体结构。四聚体的总体结构：YbaS（A）和YbgJ（B）。蛋白质亚基以不同的颜色显示。YbaS（C）和YbgJ（D）的亚单位结构显示潜在的活性位点。二级结构元素以不同的颜色显示（α-螺旋，青色；β-链，洋红；环，鲑鱼色），并在YbgJ结构中编号（D）。潜在活性位点位于α3、α6和β8之间的区域，催化Ser（YbaS中的Ser66和YbgJ中的Ser74）的位置由两个结构中心的黑色箭头指示。
图3
图3
YbaS（A）和YbgJ活性位点与结合DON（B）的特写立体图。二级结构元素以不同的颜色显示（α-螺旋，红色；β-链，黄色；环，绿色）。保守催化残基和DON的侧链显示为棒状物（氮原子，蓝色；氧原子，红色；DON的碳原子，氰）。注意，YbgJ脱酰胺DON产生5-氧代-我-去甲亮氨酸（ON）与酶共价结合。
图4
图4
谷氨酰胺酶和β-内酰胺酶活性位点的比较。YbgJ和（A）类Aβ-内酰胺酶RTEM-1活性中心关键催化残基重叠的立体观察大肠杆菌（1fqg）或（B）C类β-内酰胺酶AmpC来自泄殖腔大肠杆菌P99（1xx2）。YbgJ残基的侧链以绿色显示，β-内酰胺酶残基以青色显示。显示了YbgJ残基的数量，而括号中的残基是指A类β-内酰胺酶RTEM-1（A）或C类β-内酰胺酶AmpC（B）的等效残基。RTEM-1中没有与Y253对应的残留物，AmpC中也没有与Y201对应的残渣。使用组合延伸法在整个蛋白质上进行叠加（64）。YbgJ/RTEM-1叠加的rmsd为3.5º，而YbgJ/AmpC叠加的rmsd为3.3º。
图5
图5
YbaS的丙氨酸替代突变：纯化突变蛋白的谷氨酰胺酶活性。反应混合物含有25 mM谷氨酰胺和0.2µg YbaS，按照实验程序进行连续分析。
图6
图6
YbgJ–DON复合物催化位点立体图。省略图是通过从模型中省略两个DON残基并用甘氨酸取代两个Ser74残基而生成的。绿色密度表示结果F类o（o）−F类c（c）地图轮廓为2.3σ。该图围绕YbgJ/DON复合物模型显示（未显示结合水分子）；不对称单元中A分子共价结合的DON（氰碳原子）周围的蛋白质残基（白炭原子）显示为棒状表示，并标记了几个与DON接触的残基。
图7
图7
建议的约束模型我-YbgJ活性部位的谷氨酰胺。
图8
图8
水解的可能反应机理我-谷氨酰胺酶。反应通过以下步骤进行：（1）Ser74氧的亲核攻击形成四面体中间体-1；（2） 分解四面体中间体-1，生成谷氨酰酶中间体和氨；（3） 水的亲核攻击和四面体中间体-2的形成；（4） 释放第二产物（谷氨酸）并形成游离酶。
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