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.2008年5月1日；68(9):3193-203.
doi:10.1158/0008-5472.CAN-07-2780。

Nutlin-3a激活p53，使其下调生长抑制因子2，上调mir-34a、mir-34b和mir-34c的表达，并诱导衰老

熊本贤介 1, Elisa A Spillare女士, 藤田考里, 伊祖米·霍里卡瓦, 山下太郎, 埃托雷·阿佩拉, 长岛真本, 竹下精一, 横田骏, 柯蒂斯·C·哈里斯
附属公司

Nutlin-3a激活p53，使其下调生长抑制因子2，上调mir-34a、mir-34b和mir-34c的表达，并诱导衰老

熊本贤介等。 癌症研究. .

摘要

Nutlin-3是一种MDM2抑制剂，激活p53，导致多种类型的癌细胞发生凋亡。尽管约50%的癌症中p53发生突变或缺失，但其余50%的癌症仍具有功能活性。因此，nutlin-3和类似药物可能是对具有功能性p53的癌症进行新辅助治疗的候选药物。细胞衰老也是由p53激活诱导的一种表型，在防止肿瘤发展中起着关键作用。在本报告中，我们发现nutlin-3a可以诱导正常人成纤维细胞衰老。Nutlin-3a激活并抑制了大量p53依赖基因，包括编码microRNA的基因。最近研究表明，mir-34a、mir-34b和mir-34c是p53介导的衰老的下游效应器，它们被上调，而生长抑制因子2（ING2）的表达被nutlin-3a抑制。在ING2启动子调控区发现两个候选p53-DNA结合共识序列；因此，我们进行了染色质免疫沉淀和电泳迁移率变化分析，并确认p53直接与这些位点结合。此外，含有ING2调节区的构建物的荧光素酶活性在p53激活后受到抑制。ING2的反义敲除诱导p53依赖性衰老，而ING2过度表达诱导p53相关性衰老。总之，我们得出结论，nutlin-3a通过激活正常人成纤维细胞中的p53诱导衰老，p53介导的mir34a、mir34b和mir34c上调和ING2下调可能参与衰老途径。

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数字

图1
图1
Nutlin-3a以p53依赖性方式诱导原代和永生化正常人成纤维细胞衰老。A、，正常人成纤维细胞、GM08402和NHF-hTERT用10μmol/L的nutlin-3a、nutlin-3 b处理或不处理(NT公司)治疗后进行SA-β-半乳糖测定。放大倍数，200倍。B中，三株原代成纤维细胞株GM08402、IMR-90和MRC-5用10μmol/L的nutlin-3a、nutlin-3 b处理或不处理7 d。计算SA-β-gal染色的细胞百分比。柱，三个独立实验中每盘五个随机场的平均值；巴，标准偏差。C、，NHF-hTERT、E6表达细胞系（NHF-hERT E6）和p53 shRNA-表达细胞系。柱，如上所述；酒吧，标准偏差。D、，用10μmol/L的nutlin-3a处理NHF-hTERT、NHF-TERT E6（E6）和NHF-hERT p53 shRNA（p53 shRNA）细胞(3a年)，坚果素-3b(3亿)或不治疗24小时。作为阳性对照，每个细胞系用1μmol/L阿霉素处理(道克斯)24小时。用所示抗体对这些细胞的细胞裂解液进行免疫印迹。
图2
图2
nutlin-3a以p53依赖的方式增加mir-34的表达。A、，NHF-hTERT细胞用10μmol/L nutlin-3a处理指定时间点。从每个处理过的细胞中提取的总RNA（10ng）用于实时逆转录-PCR（RT-PCR）分析mir-34a、mir-34b和mir-34c以及RNU66的表达。RNU66转录本用作内部控制。统计分析由Student’s吨测试。柱，三个独立实验的平均值；酒吧，标准偏差。B中，未经处理或用10μmol/L nutlin-3a处理所示人类肿瘤细胞系24 h。然后提取总RNA（10 ng），并用于实时RT-PCR分析mir-34a和RNU66的表达。RNU66转录本用作内部控制。统计分析由Student’s吨测试。柱，三个独立实验的平均值；酒吧，标准偏差。C、，然后从上述相同细胞系中提取总RNA（10 ng），并用于实时RT-PCR分析mir-34b和RNU66的表达。RNU66转录本用作内部控制。统计分析由Student’s吨测试。柱，三个独立实验的平均值；酒吧，标准偏差。D、，将人类肿瘤细胞系保留未经处理或用10μmol/L nutlin-3a处理24 h。然后从细胞中提取总RNA（10 ng），并用于实时RT-PCR分析mir-34c和RNU66的表达。RNU66转录本用作内部控制。统计分析由Student’s吨测试。柱，三个独立实验的平均值；酒吧，标准偏差。
图3
图3
ING2公司nutlin-3a以p53依赖的方式降低表达。A、 用10μmol/L的nutlin-3a、nutlin-3 b处理NHF-hTERT细胞或未处理24 h的NHF-hERT细胞，进行ING2蛋白的Western blot分析。B、p53野生型细胞（HCT116、RKO、LS174T、A549、MCF-7和NHF-hTERT）、p53突变细胞（SW620、WiDr和H157）和p53无效细胞（HCT 116 p533/3，H1299和Calu-6）用10μmol/L的坚果素-3a处理24小时。加入等量的二甲基亚砜作为对照。从每个处理细胞中提取的总RNA用于实时RT-PCR分析ING2公司和GAPDH公司mRNA表达。GAPDH公司mRNA转录本用作内部对照。柱，三个独立实验的平均值；酒吧，SD。C类,顶部，HCT116 p53+/+用不同剂量的nutlin-3a（0、2.5、5、7.5和10μmol/L）处理RKO细胞24小时。底部，HCT116 p53+/+在指定的时间点（0、1、4、8和24 h），用10μmol/L nutlin-3a或等量的DMSO处理RKO细胞。ING2公司和第21页通过实时RT-PCR分析使用指定样本测量mRNA转录物。这些表达式通过GAPDH公司mRNA表达。柱，三个独立实验的平均值；酒吧，SD。D类用10μmol/L nutlin-3a处理HCT116和NHF-hTERT的p53等基因对的指定时间点。用这些细胞制备的总细胞裂解物通过Western blot分析测定ING2的表达。β-肌动蛋白被视为内部控制。
图4
图4
p53与ING2公司调控区域并抑制荧光素酶活性。A、，HCT116 p53型+/+，HCT116 p53−/−用10μmol/L nutlin-3a或等量的二甲基亚砜处理NHF-hTERT、NHF-hPERT E6和RKO细胞24小时。处理后，按照材料和方法进行ChIP。B中，EMSA是使用从候选的第53页一致的DNA结合序列ING2公司监管区域，惯性导航与制导站点1和站点2。重组p53蛋白和抗p53（DO-1）抗体用于检测移位或超移位带。每个未标记的寡核苷酸（100倍过量）被用作竞争物。C、，使用pGL-3基本载体的四种荧光素酶构建物设计为A、 B、C、和D类每1.6μg pGL-3荧光素酶报告子和0.16μg雷尼利亚荧光素酶检测载体pRL共转染HCT116和RKO细胞的p53等基因对。24小时后，向细胞中添加10μmol/L nutlin-3a或等量的二甲基亚砜12小时雷尼利亚荧光素酶活性。柱，三个独立实验中相对荧光素酶活性的平均值；酒吧，标准偏差。
图5
图5
ING2的下调导致细胞衰老。A、，用以下100 nmol/L浓度的siRNA寡核苷酸处理NHF-hTERT细胞：随机序列控制（对照）、ING2公司siRNA可将ING2水平降低近50%（ING2-1）ING-2公司siRNA几乎完全抑制ING2表达（ING2-2）24 h。处理后，向细胞中添加10μmol/L nutlin-3a或nutlin-3 b 72 h。对细胞进行SA-β-gal染色。放大200倍。B中，经过上述步骤，计算出蓝染细胞的百分比。柱，在每个实验中，每个盘子都有五个随机区域。三个单独的实验一式三份，并对结果进行平均。酒吧，标准偏差。C、，将100 nmol/L siRNA ING2-2或对照转染到041 p53−/−细胞。24 h后，用10μmol/L nutlin-3a或nutlin-3 b处理细胞72 h。进行SA-β-半乳糖测定。阳性染色细胞计数并显示为百分比。柱，同上；酒吧，标准偏差。D、，蛋白裂解物是由处理成B并用所示抗体进行免疫印迹。
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