Endosomal compartment contributes to the propagation of CD95/Fas-mediated signals in type II cells

doi:10.1042/BJ20071704

。2008年8月1日；413(3):467-78.

doi:10.1042/BJ20071704。

内膜小室参与CD95/Fas介导的信号在II型细胞中的传播

保拉·马塔雷斯¹, 瓦莱里亚·曼加内利, 蒂娜·加罗法洛, 安东内拉·蒂纳里, 甘巴德卢克雷齐亚, 肯尼思·恩德贝尔, 罗亚·科斯拉维·法尔, 莫里齐奥·索利斯, 毛罗·德格利·埃斯波斯蒂, 沃尔特·马洛尼

附属公司

PMID： 18442358
预防性维修识别码：项目经理2819661
内政部： 10.1042/BJ20071704

内膜小室参与CD95/Fas介导的信号在II型细胞中的传播

保拉·马塔雷斯等。生物化学杂志。 2008。

。2008年8月1日；413（3）：467-78。

doi:10.1042/BJ20071704。

作者

附属

¹药物研究和评估部，细胞老化和退化科，意大利罗马，里贾纳-埃琳娜小瓶299号，邮编：00161。

PMID： 18442358
预防性维修识别码：项目经理2819661
内政部： 10.1042/BJ20071704

摘要

CD95/Fas受体结扎后，不同细胞器参与细胞内信号传递，包括一系列亚细胞变化，这些变化对凋亡级联反应是强制性的，甚至是支持性的。在本研究中，我们分析了CD95/Fas参与II型细胞（CEM细胞）后，内吞在细胞死亡信号传播中的作用。我们证明，这种受体-受体相互作用独立于任何半胱天冬酶激活触发内吞作用。这种FasL（Fas配体）诱导的内吞也导致内吞小泡向线粒体室的早期定向“运动”。反过来，在内胚体和线粒体之间的这种相互作用之后，线粒体膜电位的丧失和细胞凋亡的执行。这种细胞重塑在受体诱导的依赖性细胞死亡中不存在，例如由促线粒体药物staurosporine诱导的细胞死亡，在因其多药耐药性而选择的CEM细胞系（CEM VBL100）中也不存在。在这些细胞中，FasL（Fas配体）诱导的内吞减少和细胞器串扰减少对应于凋亡减少。总之，这些发现表明内吞在CD95/Fas激活信号的传播和扩增中起着关键作用，导致II型细胞死亡。

PubMed免责声明

数字

**图1。CD95/Fas结扎和内吞**
(A类)荧光光谱法测量悬浮在林格氏缓冲液中的CEM细胞在无（对照）和有FasL的情况下摄取FM1-43后的内吞作用。其最终浓度(μg/ml）和预培养时间。作为额外的对照，我们使用中和抗人Fas IgG1单克隆抗体，克隆ZB4（黑线）。(B类)在与(A类). 用FasL（0.5）孵育20分钟后，获得五个重复孔的平均值μg/ml）或1μM离子霉素（快速内吞的诱导剂）。(C类)流式细胞术分析经FasL处理30分钟或1小时的活细胞（通过碘化丙啶排除试验选择）中CD95表面表达与未处理细胞的比较。数字代表荧光中值。注意，CD95表达仅在FasL治疗1小时后才出现轻微下降。(D类,F类)FasL诱导的内吞作用的调节。(D类)在FCS存在（白色条）或不存在（黑色条）的情况下进行的内吞作用的流式细胞术分析。报告的值表示从四个不同实验中获得的摄入右旋糖酐–FITC的细胞百分比的平均值±S.D。注意：（i）无论是否存在FCS，都可以检测到相同的趋势；（ii）在FCS停药后的细胞中检测到右旋糖酐摄取显著增加（注意所用的不同尺度）；（iii）单独给予Z-VAD-FMK或莫能菌素不会改变其对葡聚糖的摄取；（iv）虽然Z-VAD-FMK预处理并没有改变FasL诱导的右旋糖酐摄取，但莫能菌素预处理显著削弱了这一过程。(E类,F类)通过右旋糖酐-FITC摄取评估对内吞作用进行定量流式细胞术分析，该评估在有代表性的实验中获得(E类)或缺席(F类)FCS。数字表示摄入右旋糖酐–FITC的细胞百分比。阴性对照（自体荧光）报告于(**E1级**)和(**一层楼**). 添加台盼蓝抑制荧光葡聚糖的表面吸收对细胞荧光几乎没有影响(**E2级**–**E5型**对**E6公司**–**第9版**和**地上二层**–五楼对六楼–九楼)，表明大多数珠子在细胞内被内吞。请注意，Z-VAD-FMK在补充FCS的细胞或在FCS饥饿状态下的细胞中无效(**E3公司**对**E4类**和**第三层**对四层)而莫能菌素显著降低了右旋糖酐负载细胞的百分比(**E3公司**对**E5型**和**第三层**对五楼).

**图3。内吞作用的形态学证据**
(A类–C类)FasL处理CEM细胞30分钟后的透射电镜照片(A类)并持续1小时(B类). 注意内吞小泡(A类)（箭头）和线粒体附近存在的小泡(B类). (C类)更高放大率的装箱区域(B类). 注意膜泡与线粒体紧密接触。(D类)通过透射电镜观察，对FasL给药30分钟和1小时后，线粒体附近出现一个或多个小泡的细胞百分比进行形态计量和统计分析**P（P）*与未处理细胞相比<0.01。放大倍数：(A类,C）×28000。

**图4。CD95/Fas结扎后BSA内吞**
FasL处理30 min后CEM细胞BSA免疫金标记（预包埋技术）。注意内膜小泡中存在金颗粒(A类)，位于线粒体附近的小泡中(B类)，在线粒体膜上(C类箭头）和线粒体中(D类，箭头）。荧光显微镜分析也表明，与对照细胞相比(E类)，黄色染色表明CD95/Fas结扎后BSA（红色）-线粒体（绿色）覆盖层明显(F类). 箭头表示插图中包含的单元格。

**图5。CD95/Fas结扎后胞内蛋白的再分布**
未经处理或用FasL处理的CEM细胞（37°C下100 ng/ml，30 min）在裂解缓冲液中进行裂解，制备核后上清液，并将其装载在连续的10–40%（w/v）蔗糖梯度上。或者，用Z-VAD-FMK或莫能菌素预处理细胞，然后如上所述用Fas-L处理细胞。离心后，收集组分，用SDS/PAGE分离每个组分的样品，并用Western blotting进行分析。蔗糖密度梯度离心后获得的组分，未经处理或用FasL处理，或用50μM Z-VAD-FMK或10μ使用针对EEA1的多克隆抗体对上述莫能菌素进行分析(A类)，Rab5(B类)或LAMP-1(C类). 作为对照，用多克隆抗VDAC-1抗体对未经处理和FasL处理的细胞进行蔗糖密度梯度离心后获得的组分进行分析(D类)或多克隆抗CD95/Fas(E类). 注意，在CD95/Fas结扎后，LAMP-1和早期内体标记（在较小程度上）（而非CD95/Fas-）重新分布到富含VDAC-1的组分。这种再分配在用泛酶抑制剂Z-VAD-FMK预处理的细胞中几乎无法检测到，但用莫能菌素预处理可以阻止这种再分配。

**图6。基质金属蛋白酶分析**
(A类)对未经处理的对照细胞和单独或Z-VAD-FMK或莫能菌素预处理后暴露于FasL或STS的细胞进行JC-1染色后的定量和定性双参数流式细胞术分析。(A类)显示了典型实验的点图。在折线下的区域，数字表示线粒体去极化的细胞百分比(B类)使用TMRM探针对MMP进行半定量流式细胞术分析。数字表示荧光强度直方图的中值。(C类)使用JC-1探针进行的四个独立实验的结果报告为平均值±标准差。注意，Z-VAD-FMK预处理阻碍了FasL-和STS诱导的MMP损失，而莫能菌素仅显著降低FasL-线粒体效应。

**图7。Fas介导的凋亡抵抗与VBL100细胞内吞减少相关**
(A类)流式细胞术分析经FasL处理30分钟或1小时的活细胞（通过碘化丙啶排除试验选择）中CD95表面表达与未处理细胞的比较。数字代表荧光中值。注意，CD95表达仅在FasL治疗1小时后才出现轻微下降。(B类)流式细胞术分析未经处理或FasL处理30分钟的野生型CEM细胞在有无FCS的情况下的内吞作用(C类)不同实验条件下的VBL100细胞。结果表示摄入右旋糖酐–FITC的细胞百分比，报告为在使用FasL或STS治疗之前，在没有或存在Z-VAD-FMK或莫能菌素的情况下进行的四个不同实验所得数据的平均值±S.D。(D类)VBL100细胞凋亡分析。未经处理的对照细胞、单独给予FasL或STS的细胞或Z-VAD-FMK或莫能菌素预处理后的细胞经膜联蛋白V/碘化丙啶双重染色后进行FACS分析。结果报告为四个独立实验的平均值±S.D。(E类)VBL100细胞中MMP的分析。对未经处理的对照细胞和单独或Z-VAD-FMK或莫能菌素预处理后暴露于FasL或STS的细胞进行JC-1染色后进行双参数流式细胞术分析。线粒体去极化的细胞百分比报告为四个独立实验所得数据的平均值±S.D。

**图8。CD95/Fas结扎后内胚体蛋白在VBL100细胞中的再分布**
未经处理或经FasL处理的细胞在裂解缓冲液中进行裂解，制备核后上清液，并将其装载在10–40%连续蔗糖梯度上，如“实验”部分所述。离心后，收集组分，用SDS/PAGE分离每个组分的样品，并使用单克隆抗EEA1、单克隆抗Rab-5、单克隆抗体LAMP-1和多克隆抗VDAC-1进行Western blotting分析。注意，在CD95/Fas结扎后，EEA1、Rab5和LAMP-1实际上并没有改变它们的分布。

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中的注释

CD95连接和细胞内膜流动。
Reinehr R，Häussinger D。 Reinehr R等人。《生物化学杂志》2008年8月1日；413（3）：e11-2。doi:10.1042/BJ20081094。《生物化学杂志》，2008年。 PMID：18613813

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