The Bro1-related protein HD-PTP/PTPN23 is required for endosomal cargo sorting and multivesicular body morphogenesis

doi:10.1073/pnas.0707601105

.2008年4月29日；105(17):6308-13.

doi:10.1073/pnas.0707601105。 Epub 2008年4月23日。

Bro1相关蛋白HD-PTP/PTPN23是内胚体货物分类和多泡体形态发生所必需的

奥雷莉·多约特¹, 亚历克桑德·米罗诺夫, 爱德华·麦肯齐, 菲利普·伍德曼

附属公司

采购管理信息： 18434552
预防性维修识别码： PMC2359801型
DOI（操作界面）： 10.1073/pnas.0707601105

Bro1相关蛋白HD-PTP/PTPN23是内胚体货物分类和多泡体形态发生所必需的

奥雷莉·多约特等。美国国家科学院程序. 2008.

.2008年4月29日；105(17):6308-13.

doi:10.1073/pnas.0707601105。 Epub 2008年4月23日。

作者

奥雷莉·多约特¹, 亚历山大·米罗诺夫, 爱德华·麦肯齐, 菲利普·伍德曼

附属

¹英国曼彻斯特M13 9PT曼彻斯特大学生命科学学院。

采购管理信息： 18434552
预防性维修识别码： PMC2359801型
DOI（操作界面）： 10.1073/pnas.0707601105

摘要

酿酒酵母蛋白Bro1p是将内吞货物分拣到多泡体（MVBs）内腔所必需的。Bro1p的哺乳动物直系祖先尚不清楚；虽然Alix是一种结构相关的蛋白质，支持病毒出芽的拓扑相似过程，但迄今为止，功能研究尚未确定Alix在MVB形成中的作用。为了确定Alix或类似蛋白是否参与内体分选，我们将一种逆转录病毒肽与报告受体结合。这种嵌合体被有效地从早期内体分离到晚期内吞室的内腔。令人惊讶的是，耗尽Alix并没有阻止排序，而是需要Alix相关蛋白His域磷酸酪氨酸磷酸酶（HD-PTP）/His-domain/N23型蛋白酪氨酸磷酸酯（PTPN23）。HD-PTP的耗竭还减少了向溶酶体的液相标记物和EGF受体的转移，导致泛素化蛋白在内胚小室的积累，并破坏MVB的形态发生。使用抗RNAi版本的HD-PTP和HD-PTP突变体进行的救援实验表明，HD-PTP Bro1结构域具有重要作用，ESCRT-III结合与完全生物活性相关。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

**图1。**
HIV p6晚期结构域将TfR-GFP从内吞再循环途径转移。用TfR-GFP转染细胞(一和b条)，p6-TfR-GFP(*c（c）*和d日)，myc-p6-TfR(*e（电子）*)，或p6-TfR-GFP（6KR）(*（f）*)显示GFP荧光(一,*c（c）*、和*（f）*)并为TfR染色(b条和d日)或myc(*e（电子）*). （比例尺，10μm）

**图2。**
p6-TfR被输送到晚期内吞腔。(A类)转染p6-TfR-GFP的细胞(一)，myc-p6-TfR(b条)或TfR-GFP(*c（c）*)使用GFP或myc抗体对EM进行免疫标记。箭头显示了标记内体的纳米金增强颗粒的示例。（比例尺，0.4μm）(B类) (左侧)将转染myc-p6-TfR的细胞与Alexa脉冲相结合⁵⁹⁴Tf，然后固定并用抗myc染色。箭头显示了同位化的示例。星号表示未转染的细胞。（比例尺，10μm）(赖特)通过宽视野显微镜对上述处理的转基因细胞进行成像。计算每个细胞[未转染（cont）124个细胞、myc-TfR 40个细胞和myc-p6-TfR 45个细胞]的平均Tf荧光强度。数值为平均值±SEM。

**图3。**
p6-TfR-GFP分选的分子表征。(A类)转染p6-TfR-GFP和WT的细胞(上部)或dn(下部)VPS4B-myc用抗myc免疫染色。(B类) (上部)p6-TfR-GFP图，表示PTAP和LYP-LRSLF基序。(下部)用p6-TfR-GFP转染细胞(左侧)或LYP-LRSLF中含有p6-TfR-GFP突变(居中)或PTAP(赖特)如图所示。(C类)去除Alix的细胞转染p6-TfR-GFP，与溶酶体抑制剂孵育，然后标记EEA1(上部)或LAMP1(下部). 箭头表示缺少EEA1和包含LAMP1的p6-TfR-GFP结构的示例位置。（比例尺，10μm）

**图4。**
HD-PTP对内吞贩运至关重要。(A类)用HA标记的HD-PTP和dn VPS4B-myc转染细胞，然后按指示进行免疫染色。(B类)用HD-PTP RNAi处理的细胞转染p6-TfR-GFP，用溶酶体抑制剂孵育，并成像以进行GFP或EEA1染色。(C类)将耗尽层粘连蛋白A或HD-PTP的细胞脉冲标记为¹²⁵I EGF并追踪，然后分析EGF降解情况（正方形、实线）、再循环情况（三角形、虚线）或细胞保留情况（圆形和虚线）。数值为三个实验的平均值±SEM，每个实验重复进行。(D类)去除层粘连蛋白A或HD-PTP并转染HA-Ubiquitin的细胞(*居中右对齐*)与Alexa同步⁵⁵⁵EGF并按指示染色。箭头突出显示EGF与标记物的共定位，箭头突出显示缺少EGF的HA-Ub阳性结构的示例。(E类)如图所示，将耗尽的细胞与EGF孵育10分钟，清洗以去除表面标签，然后固定。（比例尺，10μm）。

**图5。**
HD-PTP对维持早期内体形态和功能至关重要。(A类)层粘连蛋白A耗尽的细胞(一和d日)、HD-PTP(b条,*e（电子）*、和*（f）*)或TSG101(*c（c）*)用BSA-15 nm金脉冲相位(*a–c*)或HRP-EGF(*d–f日*)箭头指示HRP-EGF浓度的区域。（比例尺，600 nm。）(B类) (上部)RNAi处理的细胞用抗TfR进行免疫染色。(下部)用Alexa对细胞进行脉冲处理⁵⁹⁴Tf和固定。每个样本使用相同的采集设置。（比例尺，10μm）(C类)RNAi处理的细胞被固定并进行LAMP1染色。（比例尺，10μm）(D类)测量了来自RNAi处理细胞的280个溶酶体的直径，并将其分组到所示的大小范围内。

**图6。**
HD-PTP Bro1结合的分子解剖。(A类)Alix、HD-PTP或HD-PTP（L202D）或（L202D/I206D）突变体的His-tagged细菌表达的Bro1结构域与预先加载GST-CHMP4B或对照珠的GSH珠培养。结合后，考马斯公司对样品进行分析(上部)或者用抗-His蛋白涂抹Western blot(下部). 箭头指示绑定Alix和HD-PTP Bro1域的位置。存在CHMP4B带和少量CHMP4B降解产物。(B类)体外翻译的HD-PTP，指示的突变体(左侧)或Bro1-V结构域和指示突变体(赖特)用预先加载GST或GST-CHMP4B的GSH珠培养。GST-CHMP4B绑定的加载控件如下所示。箭头指示全长HD-PTP的位置。(C类)来自绑定已转换构造的数据。减去与GST对照的结合后，每个突变体的值表示为与WT全长HD-PTP或WT Bro1-V结构体的结合。数值为三个实验的平均值±SD。

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