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.2008年4月16日；3（4）：e2005。
doi:10.1371/journal.pone.0002005。

Cre激活病毒基因表达对小鼠脑内特定神经元类型的高分辨率标记和功能调控

桑德拉·吉尔曼 1, Z乔什·黄
附属公司

Cre激活病毒基因表达对小鼠脑内特定神经元类型的高分辨率标记和功能调控

桑德拉·吉尔曼等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

我们描述了一种方法，该方法将Cre-rebusise-knockin小鼠和病毒介导的基因转移结合起来，对小鼠大脑中的特定神经元类型进行遗传标记和功能操作。我们在Cre/loxP重组介导的转录翻译STOP盒去除后，构建了表达GFP、dsRedExpress或通道视紫红质（ChR2）的腺相关病毒（AAV）。荧光标记足以显示体内具有突触分辨率的神经元结构，而ChR2的表达允许神经元放电的光激活。在一周的时间里，对一类特殊的新皮质神经元，即含有小白蛋白（Pv）的快速尖峰GABA能中间神经元的结构动力学进行了监测。我们发现，尽管大多数Pv轴突波顿在年轻人中是稳定的，但在7天内，轴突轴上的波顿增减率分别为10.10%和9.47%。我们的结果表明，Pv抑制回路维持了青春期后大脑皮层结构再布线的潜力。随着越来越多的Cre敲除小鼠的产生，并且由于病毒转染可以在特定的发育阶段传递到特定的大脑区域，该策略代表了一种通用方法，可以系统地可视化小鼠大脑中不同类型细胞的结构并操纵其功能。

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数字

图1
图1。Cre激活的AAV载体在Cre敲除小鼠的大脑中提供细胞型特异性和高水平的基因表达。
（a） 将一种通用的AAV-GFP病毒注射到Pv-cre小鼠的新皮质，非特异性标记神经元。金字塔可以通过粗大的顶端树突（黑色箭头）和突出的轴突（白色箭头）来识别。（b） 注射AAV-lox-STOP-lox（LS1五十） -GFP病毒进入Pv-cre小鼠的新皮质，特异性标记表达cre重组酶的神经元。STOP盒在示意图中以灰色显示，并在方法中详细描述。Δβgeo-3xpA，一种改良的β-半乳糖苷/新霉素STOP盒，具有3个多腺苷化位点。（c） AAV-LS的注入2L-RFP病毒进入Pv-cre小鼠的新皮质，特异性标记表达cre-rewise的神经元。这里使用了一种不同版本的STOP盒，Neo-2xpA，一种具有2个聚腺苷酸位点的新霉素STOP盒。P（P）CMV公司CMV启动子和β-珠蛋白内含子；比例尺，a–c为250µm。（d） 注射AAV-LS的PV-cre小鼠新皮质篮子中间神经元中GFP和小白箭头的共定标1L-GFP；标尺，20µm。最右侧的篮状细胞轴突高分辨率图像，具有PV+中间神经元特征的“篮状”终末分支和围绕锥体细胞体（用NeuN免疫荧光标记）的花束（黄色箭头）；比例尺，5µm。（e） 注射AAV-LS的Emx-cre-nlsLacZ小鼠新皮质锥体神经元GFP和LacZ的共定标1L-GFP；标尺，20µm。请注意，并非所有LacZ+锥体神经元GFP阳性。最右边，沿着锥体细胞顶端树突的棘（蓝色箭头）；比例尺，5µm。（f） Thy1-GFP小鼠体内GFP荧光强度归一化为GFP标记锥体体强度的量化；n＝每组15个细胞。Thy1-GFP和AAV标记的体细胞的强度范围都很大，只有最亮的细胞被选中进行这一特定的比较（详见方法）。Thy1-GFP:1+/-0.08；AAV-LS型1L-GFP:：Pv-cre:1.5+/-0.1；AAV-LS型1L-GFP：：Emx-cre 1.3+/-0.2）。所有AAV注射组织在1.5–3个月大的小鼠注射后12–15天固定。
图2
图2。注射AAV-LS的Pv-cre小鼠中GFP的表达1L-GFP稳定数月。
（a） 将AAV-LS注射到Pv-cre小鼠（顶行；每个时间点3只小鼠）和野生型对照小鼠（中行；每个时刻3只小鼠1在注射后6、15、30和60天（dpi）灌注L-GFP和。60 dpi见图S3。所有的外荧光图像都是使用相同的采集参数用CCD摄像机采集的。使用了不会导致信号饱和的最大曝光时间（75 ms），并对所有显示的图像应用了相同的查找表。在Pv-cre小鼠中，GFP表达水平随时间增加。在这些条件下，在一些野生型对照小鼠（蓝色箭头）中检测到稀疏的弱信号；比例尺，100µm。最下面一行是野生型对照小鼠（蓝色）和Pv-cre小鼠（黑色）标记神经元体细胞GFP强度的量化。在注射Pv-cre的动物中，每只动物的GFP+细胞平均计数为（6,15,30 dpi）：110+/-34,215.3+/-34,195.3+/-26个细胞。（b） AAV-LS的全电池电流钳记录1以20dpi从2.5个月大的Pv-cre小鼠中转染L-GFP的神经元。左，记录细胞的DIC图像；插图显示GFP荧光；比例尺，10µm。对，响应250 pA电流阶跃的峰值的示例轨迹；比例尺，10 mV，25 ms。
图3
图3。功能性证明Cre激活的AAV载体具有细胞类型特异性。
向Pv-cre小鼠注射AAV-LS2制备用于电生理记录的L-ChR2mCherry和急性切片。（a–c）光刺激直接诱发ChR2阳性神经元的去极化反应。靶向记录的ChR2阳性细胞的DIC和荧光图像（a）；比例尺：10µm。在细胞连接模式（b）中记录对持续时间增加的光刺激的尖峰反应（蓝线表示为7、14和500 ms）；比例尺：40 pA，25 ms。在TTX存在下，ChR2-介导的电流保持不变。（c） ；比例尺：50 pA，10 ms（d）电场刺激诱发抑制性突触后电流（上迹线，保持电位设置为AMPA/NMDA介导电流的反转电位，0 mV）和兴奋性突触前电流（下迹线，维持电位设置为GABA介导电流反转电位，−55 mV），以全细胞电压灯模式记录在金字塔细胞中；比例尺：40 pA，20 ms（e）光刺激特异性诱发抑制性突触后电流（上迹线），未检测到兴奋性突触前电流（下迹线）；比例尺：20 pA，20 ms。在相同的记录条件下，检测到抑制性和兴奋性自发突触事件；比例尺：20 pA，50 ms。
图4
图4。体内Pv-cre小鼠中GFP标记篮子中间神经元的双光子成像。
（a） z系列从软脑膜表面以下～20µm处开始，从密集标记区域到～120µm深度的低放大投影。星号表示两个细胞体的顶部。许多树枝状分支用蓝色箭头表示。（b–c）（a）中突出显示的区域在两个不同深度的高倍z投影：软脑膜下85–90µm（b）和65–75µm。请注意光滑的白杨树突（蓝色箭头）和大小不等的密集的树突簇（黄色箭头）。（d） z系列从稀疏标记区域投射到软脑膜下方60–170µm处，显示出一个孤立的GFP标记篮子中间神经元。树突（蓝色箭头）可以追溯到胞体，轴突突起（黄色箭头）在这个放大倍数下表现为混浊信号。（e–f）从（d）中灰框所示区域放大的轴突形态示例。（e） 图中所示为轴突篮状结构（星号），（f）所示为分离良好的轴突分支（黄色箭头），带有明显的花束（黄色箭头所示）。（g–h）（d）中所示区域的枝晶结构。细胞的树突状物大部分呈白杨色（g），尽管偶尔在一些树突状分支上可见小突起（h）。比例尺a、d：20µm；b–c、e–h:5µm。
图5
图5。篮子中间神经元体内结构动力学的慢性双光子成像。
（a） 轴突分支和轴突的形态图像示例，在两天的过程中两者都是稳定的。（b） 观察了一周的成像间隔，其中轴突分支和突起基本稳定（黄色箭头），轴突轴上的增加（蓝色箭头）和减少（红色箭头）。注意，第7天没有显示两个最右边的波顿。（c） 轴突隆起增加和减少的比例（检测的隆起总数=183，来自三只动物）。（d） 新形成的石柱至少持续两天（蓝色箭头）的例子。比例尺：5µm。
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