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.2008年4月；13(4):355-64.
doi:10.1016/j.cr.2008.02.010。

INK4抑癌基因之间的反馈回路限制人类胶质母细胞瘤的发展

鲁普列希特·维德梅耶 1, 卡梅隆·布伦南, 蒂莫西·P·赫夫南, 肖永红, 约翰·马奥尼, 阿列克谢·普罗托波波夫, 郑洪武, 格雷厄姆·比格内尔, 弗兰克·富纳里, 韦伯斯特·K·卡文尼, 威廉·C·哈恩, 一村Koichi Ichimura, V彼得·柯林斯, 杰拉尔德·朱棣文, 迈克尔·斯特拉顿, 基思·利贡, P安德鲁·福特雷尔, 琳达·琴
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INK4抑癌基因之间的反馈回路限制人类胶质母细胞瘤的发展

鲁普列希特·维德梅耶等。 癌细胞. 2008年4月.

摘要

我们开发了一种非启发式基因组地形扫描（GTS）算法来描述人类胶质母细胞瘤（GBM）基因组改变的模式，识别频繁的p18（INK4C）和p16（INK4 a）代码缺失。GBM细胞中p18（INK4C）的功能重建对p16（INK4 A）和p18（InK4 C）均无效，导致细胞周期进展和致瘤潜能受损。相反，RNAi介导的p16（INK4A）缺陷的原代星形胶质细胞或已建立的GBM细胞中p18（INK4 C）的缺失增强了体内外的致瘤性。此外，原代星形胶质细胞中p16（INK4A）的急性抑制诱导p18（INK4 C）的伴随增加。总之，这些发现揭示了星形细胞谱系中的反馈调节电路，并证明了人类GBM中p18（INK4C）的真正抑癌作用，其中p18与其他INK4家族成员协同作用以抑制不适当的增殖。

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数字

图1
图1
经GTS鉴定的GBM癌基因组分析CDKN2C型删除（A）GBM癌基因y轴ARI的Skyline剖面。AFI由基于百分位等级的色标表示，突出显示了最集中的改变区域。（B） 放大（左）和删除（右）的对数（ARI）（x轴）和对数（AFI）（y轴）的二维GTS图。黑色外圆标志着ROI在GTS得分前50名中排名（表1）。红色圆圈标记跨越签名事件的ROI。经常获得的chr7上的ROI在放大图上用蓝色标记。同样，chr10上的ROI在删除图上用蓝色标记。注意MET或PTEN分别与Chr7或Chr10事件分离。（C） 删除ROI跨越CDKN2C型存在于4/28个胶质母细胞瘤肿瘤样本中（显示了两个例子），定义了2Mbp的局灶性最小共同缺失区（虚线）。纯合缺失在胶质瘤细胞系（5/18）中很常见，并进一步细化缺失的最小共同区域第18页INK4C（墨水4C）（实线）。通过基因权重模型对拷贝数一致表达的分析（参见实验程序）表明第18页INK4C（墨水4C）在肿瘤和显示染色体缺失的细胞系中表达。两个探针组的基因权重第18页INK4C（墨水4C）在p＜0.01时具有显著性（黑圈）。GW-Sig，基因重量显著性。
图2
图2
急性抑制第16页INK4A（墨水）导致补偿性上调第18页INK4C（墨水4C）（A） E2F转录因子结合第18页INK4C（墨水4C）人类星形胶质细胞中的启动子。A类第18页INK4C（墨水4C）启动子DNA片段经抗E2F1免疫沉淀，但未经对照或RB1抗体免疫沉淀。（B） 用E2F1和E2F5的空载体或表达结构瞬时转染人星形胶质细胞。INK4和CCNE1公司转染后72小时通过RT-qPCR分析RNA表达，并将其归一化为GAPDH公司表达式。载体转染细胞的每个转录物设置为1。E2F1，但不是E2F5，特别增加第18页INK4C（墨水4C）（INK4C）RNA与特征明确的E2F靶点的程度相似CCNE1公司误差条表示平均值±标准偏差。（C） 星形胶质细胞来自第53页−/−第2代小鼠用非靶向siRNA（siNT）或siRNA靶向转染第16页墨水4a（siInk4a）并检测p18墨水4c转染72小时后蛋白表达。负荷控制，长春花碱。（D） 老鼠第53页−/−用siNT或siInk4a转染星形胶质细胞和正常人原代星形胶质细胞，并检测其RNA表达水平第16页墨水4a（墨水4a），第15页墨水4b（墨水4b），第18页墨水4c（Ink4c），以及第19页墨水4d转染后72小时通过RT-qPCR检测（Ink4d）。siNT转染的细胞与Ink4表达相比的相对水平在标准化至Gapdh公司误差条表示平均值±标准偏差。
图3
图3
第18页INK4C（墨水4C）在中停用第16页INK4A（墨水）空白GBM细胞系增强致瘤性（A）GBM细胞，LN-229(第16页INK4A（墨水）/第18页INK4C（墨水4C）空）、LN-18、Hs683（两者第16页INK4A（墨水）无效的，第18页INK4C（墨水4C）WT）和LN-Z308(第16页INK4A（墨水）/第18页INK4C（墨水4C）重量，CDK4/细胞周期蛋白D1-扩增）感染逆转录病毒表达构建物的小发夹靶向性第18页INK4C（墨水4C）在第14天对软琼脂中的菌落形成进行评分，并绘制成shNT对照组的百分比。误差条表示重复项的标准偏差。抑制第18页INK4C（墨水4C）LN-18和Hs683中的菌落数量显著增加（shINK4C-2和shINK4 C-5分别为p=0.01和p=0.006）。学位第18页INK4C（墨水4C）通过RT-qPCR测定shNT感染细胞（100%）的敲除率，见下表。误差线表示平均值±标准偏差。（B）第16页INK4A（墨水）/第18页INK4C（墨水4C）无GBM线路U87MG和LN-229以及第16页INK4A（墨水）/第18页INK4C（墨水4C）重量，CDK4/细胞周期蛋白D1-扩增的LN-Z308稳定感染标记p16的逆转录病毒表达结构INK4A（墨水）（INK4A旗帜)，标记为p18的标志INK4C（墨水4C）（INK4C旗帜)，重量p18INK4C（墨水4C）（INK4C）或空载体（vector）在软琼脂中进行菌落形成分析。在第14天对软琼脂集落进行染色和计数，并绘制成相对于载体感染细胞的百分比±标准偏差（U87MG-vector 100%，U87MG-INK4C旗帜23±2%[p=0.0005]，U87MG-INK4A旗帜18±2%【p=0.0003】；LN-229矢量100%，LN-229-INK4C旗帜23±3%[p=0.0002]，LN-229-INK4A旗帜11±2%（p=0.0001]）。比例尺指示2 mm。（C）GBM细胞株LN-229(第16页INK4A（墨水）/第18页INK4C（墨水4C）空）、LN-444、LN-18（两者第16页INK4A（墨水）无效的，第18页INK4C（墨水4C）WT）和LN-Z308(第16页INK4A（墨水）/第18页INK4C（墨水4C）重量，CDK4/细胞周期蛋白D1-扩增）感染载体控制（vector），WT p18INK4C（墨水4C）（INK4C）或p18墨迹4c对变异体（F37I和A61D）进行软黄集落形成分析，如（B）所示。两个p18INK4C（墨水4C）变异体抑制菌落形成的能力降低。误差线表示平均值±标准偏差。（D） 稳定的LN-229细胞群如（C）所示。野生型，但不是突变型，p18INK4C（墨水4C）与CDK6（p18）共免疫沉淀INK4C（墨水4C）带用星号标记）。尽管野生型p18之间存在相互作用，但与CDK4结合也观察到同样的效果INK4C（墨水4C）CDK4较弱（数据未显示）。
图4
图4
第16页墨水4a和第18页墨水4c共激活使小鼠星形胶质细胞（A）致瘤第16页墨水4a/农业研究基金用靶向GFP（shGFP）或第18页墨水4c（shInk4c）。击倒第18页墨水4c导致p18显著降低墨水4c蛋白质水平（负荷控制，vinculin）和软琼脂中明显较高的菌落形成（误差条表示四倍体的平均值±标准偏差）。（B） 将来源于（A）的稳定星形胶质细胞群皮下注射到Ncr裸鼠体内。While期间第18页墨水4c-剥夺细胞在2周内形成肿瘤，对照细胞未形成肿瘤（绘制平均值±标准差）。对照小鼠的注射部位经组织学证实无肿瘤。（C） 来自shInk4c感染星形胶质细胞的肿瘤组织学显示恶性间变性，H&E染色显示有丝分裂率高。免疫组织化学分析证实神经标记物Nestin的表达模式类似于人类星形细胞瘤。比例尺显示为30μm。（D） 检测Matrigel-embedded shGFP感染的星形胶质细胞和肿瘤衍生shInk4c感染的星形细胞第18页墨水4cRNA表达与Gapdh公司表达式确认稳定第18页墨水4c敲除肿瘤细胞。误差线表示平均值±标准偏差。
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