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.2008年3月19日；28(12):3159-69.
doi:10.1523/JNEUROSCI.5227-07.2008。

发育关键期耳蜗核神经元中NFAT（活化T细胞的核因子）的去分化诱导激活：NFATc4依赖性凋亡在中枢神经系统中的作用

杰西·罗玛 1, 兰斯·齐佩尔
附属公司

发育关键期耳蜗核神经元中NFAT（活化T细胞的核因子）的去分化诱导激活：NFATc4依赖性凋亡在中枢神经系统中的作用

杰西·罗玛等。 神经科学. .

摘要

在感觉神经元的发育和成熟过程中，正常维持需要传入活动。听觉神经元，包括前中央耳蜗核（AVCN）的神经元，依赖传入输入生存时，存在一个发育时间窗。这段时间通常被称为关键期。AVCN神经元对失神经诱导死亡易感性的细胞和分子机制尚不清楚。在这里，我们表明，只有在这一关键时期，通过活体耳蜗切除来阻断小鼠AVCN神经元的传入，才能导致转录因子NFATc4（活化T细胞亚型4的核因子）的快速核移位和活化。用钙调神经磷酸酶抑制剂FK506和特异性NFAT抑制剂11R-VIVIT进行体内治疗可消除NFAT激活。抑制NFAT可显著减弱失神经支配诱导的AVCN神经元凋亡，并消除NFAT介导的耳蜗核FasL的表达，FasL是凋亡途径的启动子。这些数据表明，在发育关键期，NFAT介导的基因表达在去分化诱导的耳蜗核神经元凋亡中发挥作用。

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数字

图1。
图1。
细胞凋亡和神经元死亡是由发育关键期的耳聋引起的。A类，CX 24小时后P7、P14和P21处用ApopTag（绿色）和DAPI（蓝色）标记的AVCN组织的荧光显微照片。显示了每个年龄时CX对侧（CTL；顶行）和同侧（底行）的AVCN。ApopTag标记在CX后的第7页普遍存在，但在第14页和第21页不存在。比例尺，75μm。B类，比较CX侧和CTL侧凋亡的AVCN神经元数量（CX:CTL），以证明CX对AVCN中神经元死亡的影响。P7小鼠（而非P14或P21小鼠）的耳蜗核神经元在术后24 h CX侧的凋亡神经元明显多于CTL侧（31.26±4.68；n个= 6;t吨= 7.90; ***第页< 0.001). 将平均值与1.0进行比较。C类，甲酚紫染色切片神经元计数测定的CX 96小时后AVCN神经元的丢失百分比。在P7岁时，AVCN神经元明显缺失（28.08±1.31；n个= 4;t吨= 21.52; ***第页< 0.001; 与0.0相比的平均值），但在P14或P21处没有显著损失。
图2。
图2。
NFATc4在发育关键期失神经后在耳蜗核激活。A类，分离AVCN细胞裂解物的Western blot数据。NFATc4主要定位于CX和CTL AVCN上的细胞质（C）时，在CX后15分钟在P7定位于核裂解物（N），而不是P14或P21。CREB被证明是有效分离核质裂解物的控制物，因为它定位于AVCN神经元的细胞核。B类细胞质和核裂解物的Western blot定量。核NFATc4 15分钟增加百分比（如A类)核NFATc4仅在CX后15分钟P7显著升高（26.6±1.28%；n个= 3;t吨= 16.08; ***第页< 0.001; 平均值与0.0比较t吨测试）。
图3。
图3。
NFATc4在CX后的AVCN神经元中在发育的关键时期被激活。A–DAVCN的荧光显微照片。CTL和15分钟CX，标记有NFATc4（红色）、DAPI核染色（蓝色）以及NFATc5和DAPI的共定位（绿色）。A类，NFATc4和DAPI的标记共定位显示在P7处CX的同侧。B类，方框区域的放大倍数如所示A类.C类（第14页）和D类（P21），CX后CTL或CX AVCN神经元几乎没有共定位。E类对15、30、45或60分钟失神经小鼠的免疫组织化学图像分析显示NFATc4核移位的时间进程。核NFATc4在P7（□）15min时显著增加（23.62±4.51%；n个= 3;t吨= 16.14; ***第页<0.001），30分钟（6.71±4.51%；n个= 3;t吨= 4.58; **第页<0.01）和45分钟（4.78±4.50%；n个= 3;t吨= 3.27; *第页<0.05）。在任何时间点，P14（▲）和P21（○）AVCN在CX后均未显示核NFATc4的显著增加。比例尺：A类,C类,D类75微米；B类，25微米。数据分析采用双向方差分析。
图4。
图4。
NFATc4的激活是在发育关键期诱导细胞凋亡的前体。A类，细胞组分的Western blot分析数据。用30mg/kg的NFAT抑制剂肽11R-VIVIT（VIV）或CaN抑制剂FK506预处理减轻了CX后15分钟P7小鼠耳蜗核中NFATc4的增加。用生理盐水（sal）预处理作为载体对照（23.19±1.24%）；t吨= 18.67; **第页<0.01），与未经治疗的（−）动物无差异（26.60±1.28；t吨= 20.74; **第页< 0.01). 使用配对t吨经检验，平均值为0.0。B类CX后24小时，P7小鼠ApopTag标记的AVCN神经元的荧光显微照片。显示的图像是CX同侧的AVCN.与未经治疗和盐处理的动物相比，预处理30 mg/kg（VIV 30）导致ApopTab标记减弱。比例尺，75μm。C类、图像分析（如中所示B类)比较CX同侧与对侧凋亡神经元数量。VIV 30预处理（6.45±0.40；n个= 5;t吨= 6.131;***第页<0.001），VIV 20（20 mg/kg；10.80±2.98；n个= 7;t吨= 6.423; ***第页<0.001）或FK506（4.31±0.96；n个= 4;t吨= 7.30; ***第页<0.001）显著减弱CX后24 h P7 AVCN神经元的失神经诱导ApopTag标记。采用单因素方差分析比较未治疗组与平均值。
图5。
图5。
AVCN的神经元丢失部分依赖于NFAT的激活。A–E，P7岁时AVCN的甲酚紫染色切片显示，完整AVCN中的神经元数量更大(A类)与经历96小时CX的失神经AVCN相比(B类).C类,D类，用30 mg/kg 11R-VIVIT（VIV）预处理后，完整AVCN之间的神经元数量没有明显差异(C类)CX AVCN的96小时(D类). 上半部的方框区域A–D放大并显示在每个面板的下半部分。比例尺：A类顶部，140μm；A类，底部，35μm。E类，图像分析，如所示A–D与VIV预处理的未处理组（−）相比，P7岁时的神经元丢失百分比显著降低（30 mg/kg，11.08±0.91；t吨= 9.42; ***第页<0.001）或FK506（8.00±1.41；t吨= 11.12; ***第页< 0.001; 与−组相比的平均值（单向方差分析）。
图6。
图6。
FasL的表达伴随NFATc4的激活，并可能在发育关键期的NFAT依赖性凋亡中发挥作用。A类，数据通过半定量RT-PCR获得。在P7，正常人CX后1h FasL mRNA表达显著增加（1.85±0.22；n个= 4;t吨= 3.81; *第页<0.05）和盐处理（sal）（1.73±0.15；n个= 3;t吨= 4.93, *第页<0.05）动物。用11R-VIVIT（VIV）（30 mg/kg）或FK506预处理可减弱CX后FasL mRNA的增加t吨测验。B类，Fas和FasL的半定量RT-PCR显示了CX诱导的基因转录效应的特异性。除GAPDH外，还使用了看家基因S15和RPL3，以确保CX不会影响负荷控制。Fas的表达无明显的平均折叠变化。FasL表达的平均倍数变化在不考虑看家基因的情况下仍然显著（GAPDH，1.85±0.22，t吨= 3.81, *第页< 0.05; S15，1.64±0.12，t吨= 5.46, *第页< 0.05; RPL3，2.48±0.22，t吨= 6.71, *第页< 0.05). 与1.0比较的平均值（成对）t吨测验。C类，用Western blot分析检测CX在P7作用6h后FasL蛋白的表达。显示了非去分化耳蜗核组织（1-4道）和6小时CX耳蜗细胞核组织（5-8道）的Western blot，并证明在失神经样本中FasL蛋白增加。D类FasL蛋白的Western blot分析显示，未经治疗的患者FasL蛋白质水平升高（倍变，1.20±0.07；n个= 7;t吨=11.0***第页<0.0001）和盐处理(t吨= 4.9; *第页<0.05）。VIV预处理减弱了FasL蛋白的增加。与配对t吨测试平均值与1.0进行了比较，1.0表示表达没有变化。
图7。
图7。
CX诱导耳蜗核神经元在发育关键期凋亡的模型。CX后，NFATc4被Ca/CaM/CaN激活并转位到细胞核，在细胞核中它介导死亡受体配体FasL的转录和翻译。我们假设FasL表达上调导致表达死亡受体Fas的邻近神经元凋亡。Bcl-2可能通过Fas/FasL抑制细胞凋亡的启动，在这一机制中发挥促生存作用。
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