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。2008年4月；172(4):1141-52.
doi:10.2353/ajpath.2008.070633。 Epub 2008年3月18日。

CD40配体促进血管损伤后Mac-1表达、白细胞募集和新生内膜形成

李国宏 1, 约翰·桑德斯, 梅丽莎·贝瓦德, 孙志琦, 詹姆斯·查姆利, Elena V Galkina公司, 克劳斯·莱伊, 伊恩·萨伦博克
附属公司

CD40配体促进血管损伤后Mac-1表达、白细胞募集和新生内膜形成

李国宏等。 美国病理学杂志。 2008年4月。

摘要

高胆固醇血症、糖尿病、缺血性中风或急性冠脉综合征患者中经常发现高水平的循环可溶性CD40配体（sCD40L），这预示着冠状动脉/颈动脉介入治疗后动脉粥样硬化斑块破裂和再狭窄的发生率增加。临床再狭窄的部分特征是新生内膜形成过度，但其潜在机制尚不完全清楚。本研究在动脉粥样硬化动物模型中研究了sCD40L升高在血管损伤后新生内膜形成中的作用，并探讨了相关的分子机制。喂食西方饮食的apoE（-/-）小鼠出现严重的高胆固醇血症、显著的高血糖和高水平血浆sCD40L。apoE（-/-）小鼠颈动脉剥脱损伤后的新生内膜形成被夸大。在体内，用抗CD40L单克隆抗体阻断CD40L可减弱Ly-6G（+）中性粒细胞和Gr-1（+）单核细胞的早期积聚（3天时）和Mac-2（+）巨噬细胞的晚期积聚（28天时）；它还减少了28天时过度的新生内膜形成。在体外，重组CD40L刺激血小板P-选择素和中性粒细胞Mac-1的表达以及血小板-中性粒细胞的共同聚集和粘附作用。这些作用被抗CD40L或抗Mac-1单克隆抗体所消除。此外，重组CD40L在体外刺激中性粒细胞氧化爆发和基质金属蛋白酶-9的释放。我们的结论是，sCD40L升高可能通过增强血小板P-选择素和白细胞Mac-1的表达和氧化活性，促进动脉损伤后血小板-白细胞的活化和募集以及新生内膜的形成。

PubMed免责声明

数字

图1
图1
答：免疫沉淀/Western blot分析未受损患者混合血浆中的可溶性CD40L蛋白(车道2)和电线损伤(车道3)载脂蛋白E−/−老鼠。来自线损伤apoE的血浆−/−cd40升−/−小鼠被用作阴性对照(车道1). 在两个独立的实验中也得到了类似的结果。B类：膳食C57Bl/6和膳食apoE血液样本中总胆固醇、葡萄糖和sCD40L水平的比较−/−和西方饮食apoE−/−老鼠*P（P）<0.01和**P（P）>0.05相对于条1，#P（P）<0.01，与巴2相比。
图2
图2
答：载脂蛋白E损伤左颈动脉和未损伤右颈动脉白细胞亚群的流式细胞术−/−导线损伤后3天。未受伤(一,d日)和受伤的颈动脉(b条,e（电子）)或使用(c（c）,（f）)MR1抗体治疗。FITC-LY-6G阳性中性粒细胞(a–c)和FITC-Mac-3-阳性巨噬细胞(d–f日)显示在右上象限（UR）中，如图所示。每个UR中显示的数字表示计数的活细胞总数的百分比。注意动脉损伤后中性粒细胞和巨噬细胞增加，MR-1治疗后减少。B类：三个独立实验的统计数据分析。数据表示为所示白细胞亚群在计数的总活细胞中的百分比±SD。注意Ly-6G的增加+中性粒细胞与Mac-3+动脉损伤后的巨噬细胞和MR-1治疗后的减少*P（P）<0.001和**P（P）与特定未受伤对照组相比，<0.01#P（P）<0.02和##P（P）与特定受伤组相比，<0.05。
图3
图3
答：载脂蛋白E颈动脉的运动染色代表性横截面−/−小鼠在钢丝损伤后28天。答：未经治疗的受伤船只。b：一种经同种IgG治疗的受伤血管。c：一艘经过MR1治疗的受伤船只。放大倍数，×200。面板d日总结了三组斑块面积的定量组织形态计量学。注意MR1治疗组新生内膜斑块面积显著减少*P（P）< 0.05.B类：载脂蛋白E颈动脉新生内膜斑块中巨噬细胞（Mac-2）和SMC（SMα-actin）含量的定量免疫细胞化学−/−小鼠剥蚀损伤后4周和动脉粥样硬化性西方饮食5周。注意，MR-1治疗组巨噬细胞含量显著减少，SMC含量无显著变化*P（P）< 0.05.抄送：载脂蛋白E中的脂质分布−/−小鼠在颈动脉钢丝损伤前1周和损伤后4周喂食西式饮食。伤后28天直接心脏穿刺采集全血标本。MR1治疗组、同种型IgG治疗组和未治疗组在总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和甘油三酯（TG）水平方面没有显著差异。
图4
图4
答：CD40 mRNA表达的逆转录酶-聚合酶链反应分析。从CD40缺乏小鼠的巯基乙酸合法腹膜中性粒细胞中提取细胞总RNA(车道1)，野生型C57BL6J小鼠(车道2)和来自小鼠单核细胞J774A.1细胞(车道3，阳性对照）。注意C57Bl/6J小鼠腹腔中性粒细胞中存在CD40 mRNA。M、 100 bp聚合酶链反应DNA标记。β-肌动蛋白作为负荷控制。B类：CD40蛋白表达的Western blot分析。从C57BL/6J小鼠的巯基乙酸合法腹腔中性粒细胞中提取细胞总蛋白(车道1)来自小鼠单核细胞J774A.1细胞(车道2，阳性对照）。用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离全细胞裂解物中的蛋白质（20μg蛋白质/车道），并用山羊多克隆CD40抗体（T-20）进行免疫印迹。CD40糖蛋白带的长度为48 kd。注意C57Bl/6J小鼠腹腔中性粒细胞中存在CD40蛋白。
图5
图5
答：CD40L刺激中性粒细胞Mac-1整合素的表达。用rm-CD40L（100 ng/ml）刺激C57BL6小鼠分离的腹腔中性粒细胞，不用或用10μg/ml的抗小鼠CD40单抗（HM40-3）、抗小鼠CD40L单抗（MR1）或仓鼠IgG（Iso）预处理（30分钟）。阳性对照使用佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐（50 ng/ml）刺激中性粒细胞。通过CD11b（Mac-1的αM链）的荧光激活细胞分选分析测定Mac-1的表达。所示数据为三个独立实验的平均荧光强度，表示为平均值±标准差*P（P）与bar 1相比，<0.01**P（P）<0.05，与巴3相比。B类：CD40L促进中性粒细胞与活化的表面粘附血小板的牢固粘附。将从C57BL6小鼠分离的腹腔中性粒细胞添加到表面粘附的血小板中。用rm-CD40L（100 ng/ml）刺激中性粒细胞粘附，无需或通过10μg/ml抗小鼠CD11b单克隆抗体（M1/70，Mac-1αM链）或大鼠IgG2b（Iso）预处理（30分钟）。阳性对照使用佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐（50 ng/ml）刺激中性粒细胞。按照材料和方法中的描述测量中性粒细胞粘附。所示数据为三个独立实验的平均值±SD*P（P）<0.01，与指示条件下的bar 1相比**P（P）<0.05，与第3条指示条件相比。
图6
图6
CD40L通过磷脂酰肌醇3-激酶和Src激酶依赖性信号通路促进中性粒细胞氧化爆发。中性粒细胞等分（2′105在37°C下用1 mmol/L DHR123负载200 ml的细胞5分钟，然后用100 ng/ml rh-CD40L结合抗人CD40L单克隆抗体（TRAP1，1 mg/ml）或抗人CD11b/Mac-1（ICRF44，1 mg/ml）单克隆抗体或在磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂（LY294002，1.0 mmol/L）的存在下刺激或Src激酶抑制剂（PP2，1.0 mmol/L）在37°C下保持30分钟。数字表示流式细胞术测定DHR在绿色荧光（FL1）通道中的平均荧光强度。从三个单独的实验中观察到类似的结果。
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