PHDs overactivation during chronic hypoxia "desensitizes" HIFalpha and protects cells from necrosis

doi:10.1073/pnas.0705680105

.2008年3月25日；105(12):4745-50.

doi:10.1073/pnas.0705680105。 Epub 2008年3月17日。

慢性缺氧期间PHD过度激活可“脱敏”HIFalpha并保护细胞免受坏死

阿曼丁·吉诺维斯¹, 卡琳·伊尔茨, 努里亚·马西亚斯, 雅克·鲍伊斯（Jacques Pouysségur）, 埃德恩·贝拉

附属公司

PMID： 18347341
预防性维修识别码：项目经理2290777
内政部： 10.1073/pnas.0705680105

慢性缺氧期间PHD过度激活可“脱敏”HIFalpha并保护细胞免受坏死

阿曼丁·吉诺维斯等。美国国家科学院程序. 2008.

.2008年3月25日；105(12):4745-50.

doi:10.1073/pnas.0705680105。 Epub 2008年3月17日。

作者

阿曼丁·吉诺维斯¹, 卡琳·伊尔茨, 努里亚·马西亚斯, 雅克·鲍伊斯（Jacques Pouysségur）, 埃德恩·贝拉

附属

¹法国尼斯安托万·拉卡萨涅中心尼斯大学国家科学研究中心信号、发育生物学和癌症研究所，UnitéMixte de Recherche 6543，邮编06189。

PMID： 18347341
预防性维修识别码：项目经理2290777
内政部： 10.1073/pnas.0705680105

摘要

细胞对氧（O（2）可用性变化的适应由O（2）依赖酶的两个亚家族控制：缺氧诱导因子（HIF）-脯氨酸和天冬酰胺羟化酶[脯氨酸羟化酶域（PHD）和抑制因子HIF（FIH）]。这些氧传感器调节HIF的活性，HIF是O（2）内环境稳定的核心转录复合物。在氧合良好的细胞中，PHD使HIFalpha亚单位羟基化，从而将其作为蛋白酶体降解的靶点。相反，急性缺氧抑制PHD，导致HIFalpha稳定。然而，在这里，我们发现慢性缺氧会在细胞和小鼠中诱导HIF1/2alpha“脱敏”。基于这种普遍的适应机制，我们证明慢性缺氧不仅会增加PHD的数量，而且会过度激活三种PHD亚型。这种过度激活似乎是由线粒体呼吸抑制导致细胞内O（2）可用性增加介导的。通过使用细胞内和体内siRNA，我们发现PHD是触发HIFalpha脱敏的关键酶，这是保护细胞免受坏死细胞死亡的反馈机制，从而使其适应慢性缺氧。因此，PHD作为双酶，其失活和随后的过度激活分别是细胞在急性或慢性缺氧中生存所必需的。

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利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

**图1。**
慢性缺氧时HIFα蛋白水平下降。细胞在缺氧条件下培养不同时间，并通过Western blotting分析HIF1α、HIF2α和β-肌动蛋白（负荷控制）的水平。(一)1%O下的HeLa细胞₂. (b条)3%和0.1%O条件下的HeLa细胞₂. (*c（c）*)1%O下的HT1080和NHF电池₂.

**图2。**
慢性缺氧依赖羟化-pVHL-蛋白酶体途径促进HIFα蛋白降解。(一)1%O条件下HeLa细胞的缺氧动力学₂用RT-PCR分析HIF-1α、HIF-2α和36B4 mRNA水平。(b条)RCC4细胞（pVHL缺乏）或稳定克隆RCC4-pVHL（过度表达pVHL）在常氧（20%O）下培养₂)或缺氧（1%O₂)在不同的时间段。(*c（c）*)HeLa细胞在常压（20%O）下培养₂)或缺氧条件（1%O₂)在裂解前4小时或5天以及4小时内，在有或无DMOG（1 mM）的条件下培养细胞。通过Western blotting分析HIF1α、HIF2α和β-肌动蛋白（负荷控制）的水平。(d日)293个细胞在常压氧（20%O₂)或缺氧（1%O₂)在不同时间段和裂解前48小时，用HIF1αWT或DM构建物转染细胞。使用Myc-tag抗体通过Western blotting分析HIF1α水平。

**图3。**
慢性缺氧过度激活三个PHD。(一)显示1%O时HeLa细胞缺氧动力学期间PHD活性的放射自显影₂. (插入) [³⁵S] pVHL输入（I）和pVHL结合使用P402/564A突变体（DM）或WT GST-HIF1α结构。(b条)Western blot分析显示缺氧动力学期间PHD2和PHD3蛋白水平。(*c（c）*)为了评估每种PHD亚型的特异性贡献，在提取前48小时，用所示的siRNA转染细胞。通过Western blotting分析HIF1α、HIF2α和β-肌动蛋白的水平。

**图4。**
细胞内O₂PHD过度激活需要重新分配。1%O时CCL39和GSK3细胞的缺氧动力学₂如图所示。通过Western blotting分析HIF1α和β-肌动蛋白水平。

**图5。**
慢性低氧诱导的HIFα脱敏保护细胞免受坏死。在1%氧浓度下缺氧培养的细胞中测量细胞死亡₂用台盼蓝掺入法测定不同时间。(一)CCL39和GSK3电池(左侧)或转染siRNA靶向三种PHD亚型或一个无关序列的HeLa细胞(赖特)5天，在常压（N）或缺氧条件下培养不同时间段（4小时、3天或5天）。(b条)GSK3细胞(左侧)和HeLa细胞转染一(赖特)其中HIFα表达被沉默。细胞缺氧孵育16小时后开始siHIFα转染，每天进行，直到实验结束第3天和第5天。在N和H（4小时）条件下，siHIFα在最后24小时内转染。

**图6。**
慢性低氧诱导的细胞死亡独立于凋亡和/或自噬途径。细胞在缺氧（1%O₂)在不同的时间段。(一)流式细胞术测定亚G₁CCL39和GSK3细胞中的PI阳性群体。(b条)通过GSK3提取物上的Western blotting分析PARP和LC3蛋白。Staurosporin（1μM）用作凋亡细胞死亡激活剂。营养保存细胞被用作自噬的阳性对照。

**图7。**
小鼠通过激活PHDs使HIFα脱敏来适应慢性缺氧。(一)BL6小鼠暴露于或不暴露于8%O的缺氧₂持续6或24小时或达到8%O₂+6%O下2小时₂用免疫组织化学方法分析肾脏HIF-1α染色24 h。(b条)pVHL捕获试验是用暴露于下述实验条件下的小鼠脑提取物进行的一. (*c（c）*)BL6小鼠在暴露于8%O的缺氧条件下之前，注射靶向三种PHD亚型或一个无关序列的siRNAs 7天₂对照组小鼠也注射DFO（1200 mg/kg）作为阳性对照。采用免疫组织化学方法检测肾脏HIF1α蛋白水平。

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