Lys63-linked polyubiquitination of IRAK-1 is required for interleukin-1 receptor- and toll-like receptor-mediated NF-kappaB activation

doi:10.1128/MCB.02098-07

.2008年5月；28(10):3538-47.

doi:10.1128/MCB.02098-07。 Epub 2008年3月17日。

IL-1受体和类收费受体介导的NF-kappaB活化需要IRAK-1的Lys63连锁多泛素化

迪特里希·康泽¹, 吴传进, 詹姆斯·A·托马斯, Allison Landstrom公司, 乔纳森·阿什维尔

附属公司

PMID： 18347055
PMCID公司： PMC2423148型
内政部： 10.1128/MCB.02098-07

IL-1受体和类收费受体介导的NF-kappaB活化需要IRAK-1的Lys63连锁多泛素化

迪特里希·康泽等。分子细胞生物学. 2008年5月.

.2008年5月；28(10):3538-47.

doi:10.1128/MCB.02098-07。 Epub 2008年3月17日。

作者

迪特里希·康泽¹, 吴传进, 詹姆斯·A·托马斯, Allison Landstrom公司, 乔纳森·阿什维尔

附属

¹美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家癌症研究所免疫细胞生物学实验室，邮编：20892。

PMID： 18347055
PMCID公司： PMC2423148型
内政部： 10.1128/MCB.02098-07

摘要

通过白细胞介素-1受体（IL-1R）和一些Toll样受体（TLR）的刺激诱导TRAF6和IRAK-1的泛素化，这是NF-kappaB和有丝分裂原活化蛋白激酶激活所需的信号成分。这里我们表明，尽管TRAF6和IRAK-1在IL-1刺激下获得Lys63（K63）连接的多泛素链，但只有泛素化的IRAK-1结合NEMO，即IkappaB激酶（IKK）的调节亚单位。IRAK-1泛素化位点定位于Lys134和Lys180，这些残基的精氨酸替代会损害IL-1R/TLR介导的IRAK-1泛素化、NEMO结合和NF-kappaB活化。IRAK-1的K63连接泛素化需要具有酶活性的TRAF6，这表明它是生理相关的E3。因此，近端信号蛋白的K63连锁多泛素化是多种先天免疫受体用于招募IKK和激活NF-kappaB的常见机制。

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数字

**图1。**
NEMO结合泛素化IRAK-1，但不结合泛素TRAF6。（A）仅转染HA-标记K63泛素的293/IL-1R/TLR4细胞，在指定的时间内用IL-1刺激或不刺激，收获后用洗涤剂溶解。将裂解产物在95%的温度下在1%的SDS存在下加热5分钟，并稀释至0.1%的SDS的最终浓度，IRAK-1和TRAF6被免疫沉淀（IP）。用抗HA免疫印迹法（IB）测定K63连接的多泛素化IRAK-1和TRAF6的含量。免疫沉淀的IRAK-1和TRAF6的量通过用抗IRAK-1和抗TRAF6的免疫印迹来测定。（B）使用或不使用IL-1刺激293/IL-1R/TLR4细胞5分钟，收获并裂解。裂解液按照面板A加热并用抗IRAK-1或抗TRAF6免疫沉淀，或者用GST-或GST-NEMO涂层珠培养。用抗Ub（左面板）或抗IRAK-1和抗TRAF6（右面板）免疫印迹洗脱材料和裂解物。（C）从293/IL-1R/TLR4细胞裂解液中免疫沉淀NEMO，该细胞裂解液由加入或不加入IL-1刺激5分钟，并对IRAK-1、TRAF6和NEMO进行免疫印迹。用抗IRAK-1和抗TRAF6免疫印迹法检测裂解液中的IRAK-1、TRAF6。（D）从293/IL-1R/TLR4细胞制备的裂解物中免疫沉淀NEMO，所述裂解物已用LPS刺激指定时间并对IRAK-1和NEMO进行免疫印迹。

**图2。**
NEMO的K63连接多泛素结合是IRAK-1结合和IL-1诱导的IκB降解所必需的。（A）使用或不使用IL-1（10 ng/ml）刺激293/IL-1R/TLR4细胞5分钟后的细胞裂解物与涂有GST、GST-NEMO或GST-NEMA的珠培养^L329P型用抗IRAK-1免疫印迹（IB）。（B） NEMO是从用HA标记的NEMO（HA-NEMO）或HA标记的NEMO稳定重建的NEMO缺陷型MEF的细胞裂解物中免疫沉淀（IP）的^L329P型（HA-NEMO）^L329P型)用或不用IL-1（5 ng/ml）刺激5分钟，并用抗IRAK-1或抗HA进行免疫印迹。（C） NEMO-缺陷MEF（-/-）或用HA-NEMO或HA-NEMO重组的NEMO-缺失MEF^L329P型用IL-1（1 ng/ml）刺激指定的时间段。收集并裂解细胞，通过免疫印迹法测定IκB和NEMO的含量。（D） HA-NEMO或HA-NEMO^L329P型用0.2或0.5 ng/ml IL-1刺激细胞10 min，收获并裂解细胞，通过免疫印迹法测定IκB的数量。为了清晰起见，车道被重新排列了。（E）用载体（-）、NEMO或NEMO瞬时转染的NEMO缺陷MEF中相对光单位（RLU）测量IL-1和LPS诱导的NF-κB荧光素酶活性^L329P型.

**图3。**
IRAK-1的K63连锁多泛素化需要TRAF6 E3活性。（A） GST-TRAF6涂层珠与经体外翻译和³⁵S标记的IRAK-1，广泛洗涤，在有或无ATP和/或Ubc13/Uev1A和泛素的情况下培养。使用荧光成像仪检测IRAK-1泛素化。仅用GST涂层的珠子未检测到IRAK-1结合。（C）将野生型（WT）或TRAF6缺陷型（T6-/-）MEF的细胞裂解物（经IL-1或不经IL-1刺激5分钟）与GST-NEMO涂层珠培养，并与抗IRAK-1免疫印迹（IB）培养。（C） NEMO是从WT或TRAF6缺陷的MEF的裂解液中免疫沉淀（IP），这些MEF被IL-1刺激或不刺激5分钟，并用抗IRAK-1和抗NEMO进行免疫印迹。（D） T6细胞裂解物^−/−MEF或T6^−/−用野生型TRAF6（T6-WT）或TRAF6重组的MEF^C70A（T6-C70A）进行TRAF6免疫印迹。（E）由未刺激或IL-1刺激的T6制成的裂解物^−/−、T6-WT或T6-C70A MEFs与GST NEMO包被的珠一起孵育，并对IRAK-1进行免疫印迹。（F） IL-1诱导T6细胞NF-κB DNA结合^−/−在电泳迁移率变化分析中评估了T6-WT和T6-C70A MEF。（G）在T6的裂解物中测量IL-1诱导的p38双磷酸化（p-p38）^−/−免疫印迹法检测T6-WT和T6-C70A MEF。

**图4。**
IRAK-1赖氨酸134和180是TRAF6介导和IL-1诱导泛素化所必需的。（A）体外泛素化³⁵S标签IRAK-1（WT），IRAK-1^K134R型（K134R），伊拉克-1^K180R型（K180R）或IRAK-1^K134/180转（K134/180R）在ATP、Ubc13/Uev1A和K63-only泛素（K63O）存在下通过GST-TRAF6。通道1至通道4是提供给GST-TRAF6涂层珠的体外翻译产品。泛素化反应显示在第5至12道。（B） IRAK-1要么用抗IRAK-1免疫沉淀（IP），要么用GST-NEMO包衣珠从用载体（-）、WT、K134R、K180R或K134/180R逆转录转导的未刺激和IL-1刺激的IRAK-1缺陷MEF的裂解液中拉下。IRAK-1免疫沉淀物用抗Ub免疫印迹（IB），GST-NEMO结合材料用抗IRAK-1印迹。IRAK-1和β-actin在裂解物中的表达如底部两行所示。

**图5：。**
IL-1诱导的NF-κB需要IRAK-1赖氨酸134和180，而p38激活则不需要。（A）瞬时转染IRAK-1（WT）、IRAK-1的293/IL-1R/TLR4细胞中NF-κB的激活^K134R型（K134R），伊拉克-1^K180R型（K180R）或IRAK-1^K134/180转（K134/180R）。将数值归一化为β-半乳糖苷酶活性，并表示为与转染空载体（-）的细胞中的荧光素酶相比的诱导水平。WT、K134R、K180R和K134/180R的表达通过带有抗标记的免疫印迹（IB）进行确认。IRAK-1下方的大的非特异性带用ns表示。（B）在用NF-κB驱动的荧光素酶报告子与载体（-）、WT、K134R、K180R或K134/180R联合瞬时转染的IRAK-1缺陷MEFs中测量IL-1和LPS诱导的NF-κB荧光素酶活性。每次转染均一式三份，误差条代表平均值的标准误差。这个实验是五个独立实验的代表。（C）用载体IRAK-1或IRAK-1瞬时转染IRAK-1缺陷MEF，检测IL-1诱导的p38激活^K134/180转通过免疫印迹法测定磷酸化（p-p38）和总p38的量。

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参考文献

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1. 曹，Z.，W.J.Henzel和X.Gao。IRAK：一种与白细胞介素-1受体相关的激酶。科学2711128-1131。-公共医学
1. 曹，Z.、J.Xiong、M.Takeuchi、T.Kurama和D.V.Goeddel。1996年。TRAF6是白细胞介素-1的信号传感器。自然383443-446。-公共医学

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[4] Burns，K.、S.Janssens、B.Brissoni、N.Olivos、R.Beyaert和J.Tschopp。通过交替剪接的短形式MyD88抑制白细胞介素1受体/类Toll受体信号传导是由于其未能招募IRAK-4。《实验医学杂志》197263-268。-项目管理委员会-公共医学

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[10] 曹，Z.、J.Xiong、M.Takeuchi、T.Kurama和D.V.Goeddel。1996年。TRAF6是白细胞介素-1的信号传感器。自然383443-446。-公共医学

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