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.2008年3月1日；14(5):1470-7.
doi:10.1158/1078-0432.CCR-07-1450。

HMGA1是胰腺癌对吉西他滨耐药的分子决定因素

Siong-Seng Liau先生 1, 爱德华·黄
附属公司

HMGA1是胰腺癌对吉西他滨耐药的分子决定因素

Siong-Seng Liau先生等。 临床癌症研究. .

摘要

目的：HMGA1蛋白是胰腺腺癌过度表达的结构转录因子。我们之前已经证明，靶向HMGA1基因的RNA干扰可能是胰腺癌细胞潜在的化学增敏策略。在本研究中，我们验证了HMGA1促进胰腺癌细胞对吉西他滨的化疗耐药性的假设。

实验设计和结果：BxPC3和MiaPaCa2细胞中稳定的短发夹RNA介导的HMGA1沉默促进了对吉西他滨的化疗敏感性，吉西他宾IC（50）降低，而吉西他比诱导的凋亡和caspase-3激活增加。相比之下，在MiaPaCa2细胞中强制HMGA1过度表达促进了对吉西他滨的化疗耐药性，吉西他宾IC（50）增加，而吉西他比诱导的凋亡和caspase-3活化减少。显性阴性Akt消除了HMGA1过度表达诱导的吉西他滨化疗耐药性增加。最后，在胰腺癌裸鼠异种移植模型中，HMGA1沉默促进了体内对吉西他滨的化学敏感性。

结论：我们的研究结果表明，HMGA1通过Akt依赖机制促进对吉西他滨的化疗耐药性。针对HMGA1的靶向治疗是改善胰腺癌化疗耐药性的潜在策略。

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数字

图1
图1。BxPC3：慢病毒介导HMGA1沉默和吉西他滨化疗敏感性
A类在产生携带shHMGA1的高滴度慢病毒颗粒后，在MOI为10时用慢病毒转导BxPC3，并在用嘌呤霉素筛选后开发出稳定的转染体。利用HMGA1高度沉默的慢病毒实现了对HMGA1的稳健抑制。在BxPC3细胞中，慢病毒介导的shHMGA1几乎完全沉默了HMGA1。对照组是使用携带干扰的非靶向shRNA的慢病毒开发的稳定转染剂。B类，评估慢病毒介导的HMGA1沉默对吉西他滨化疗敏感性的影响。当HMGA1沉默的BxPC3细胞暴露于1μM吉西他滨48小时后，与对照细胞相比，他们采用了一种不太健康的推测形态。使用倒置显微镜以40倍放大率拍摄显微照片。C类，在MTS分析后分析暴露于0-10μM吉西他滨后的生存曲线。与对照组相比，慢病毒介导的BxPC3细胞中稳定HMGA1沉默使生存曲线向左移动，表明对吉西他滨的化疗敏感性增加。相应地，与对照组相比，HMGA1沉默时吉西他滨的IC50降低了4倍*P=0.001与对照shRNA。
图2
图2。MiaPaCa2：慢病毒介导的沉默和HMGA1强制过表达对吉西他滨化疗敏感性的影响
在MOI为10时用shRNA慢病毒转染MiaPaCa2细胞，然后用嘌呤霉素筛选出稳定的转染体。通过Western分析证实了HMGA1的稳定沉默（数据未显示）。本研究中使用了两个先前特征化的MiaPaCa2细胞克隆（pIRES-HMGA1.1和1.2），它们稳定地过度表达HMGA1（19）。对照组为用空pIRES-puro3载体稳定转染的细胞。A类，评估调节HMGA1表达对MiaPaCa2细胞对吉西他滨化疗敏感性的影响。在MiaPaCa2细胞中，与对照组相比，当暴露于1μM吉西他滨72小时时，慢病毒介导的HMGA1沉默导致细胞活力显著降低。相比之下，HMGA1过度表达的MiaPaCa2细胞（pIRES-HMGA1.1和1.2）在暴露于1μM吉西他滨后，与空的pIRES-puro3转染体相比，其生存能力增加。使用倒置显微镜以40倍放大率拍摄显微照片。B-C公司在pIRES-HMGA1.1和1.2克隆中，慢病毒介导的HMGA1 RNA干扰MiaPaCa2细胞导致对吉西他滨的化疗敏感性增加，生存曲线向左移动，而HMGA1过度表达导致对吉西他滨的耐药性增加，生存线向右移动，与各自的控制相比。D类，与对照组相比，使用慢病毒介导的shHMGA1靶向抑制HMGA1导致IC50降低2倍（p=0.001），而HMGA1在pIRES-HMGA1.1和1.2克隆中的过度表达导致吉西他滨的IC50分别增加约2.2和1.7倍（p=0.003和p=0.006，与空白pIRES-puro3对照组相比）*与对照shRNA转染剂相比，P<0.05**与空的pIRES-puro3转染子相比，P＜0.05。
图3
图3
A类通过流式细胞术分析YO-PRO-1/碘化丙啶染色细胞评估，慢病毒介导的HMGA1沉默促进了吉西他滨诱导的凋亡。在暴露于1μM吉西他滨24小时后，HMGA1沉默导致BxPC3和MiaPaCa2细胞的相对凋亡率增加约2倍*P=0.001与对照shRNA。显示了三个实验的典型流式细胞术图像，以三角形突出显示凋亡部分。B类根据流式细胞术评估，pIRES-HMGA1.1和1.2克隆中HMGA1的强制过表达保护细胞免受吉西他滨诱导的凋亡，相对凋亡率降低约70-80%[与空白pIRES-puro3对照组相比，P=0.001（pIRES-HMGA1.1）和P=0.002（pIRES-HMGA1.2）]*与空白pIRES-puro3对照组相比，P<0.05。C类，在细胞暴露于1μM吉西他滨24小时后，使用荧光caspase 3底物测定法测定相对caspase 2活性。慢病毒介导的HMGA1沉默促进了吉西他滨诱导的caspase 3活性*与对照shRNA转染剂相比，P=0.008（BxPC3）和P=0.005（MiaPaCa2）。D类正如预期的那样，在pIRES-HMGA1.1和1.2克隆中HMGA1的过度表达导致暴露于1μM吉西他滨24小时后caspase 3激活降低，表明对吉西他宾诱导的caspase介导的凋亡具有保护作用*P=0.001与空的pIRES-puro3转染体比较。
图4
图4
我们以前曾报道过，在MiaPaCa2细胞中，HMGA1沉默可降低Akt磷酸化，而HMGA1过度表达可促进Akt磷酸化，并且HMGA1的沉默或过度表达均不会对总Akt的表达水平产生任何影响。为了评估Akt在介导HMGA1诱导的化疗耐药中的作用，我们用携带HA标记显性阴性Akt的腺病毒转导pIRES-HMGA1.1和1.2克隆，以检测其对化疗耐药的影响。通过血凝素的蛋白质印迹来评估转导效率和显性阴性Akt的表达。与感染对照腺病毒（Ad-CMV-Null）的细胞相比，感染携带显性阴性Akt（Ad-DN-Akt）腺病毒的pIRES-HMGA1.1和1.2克隆导致吉西他滨的IC50显著降低。显性阴性Akt导致pIRES-HMGA1.1和1.2克隆中吉西他滨的IC50降低至与亲代MiaPaCa2细胞或空的pIRES-puro3转染体相似的水平，表明HMGA1过度表达相关的化疗耐药性增加被消除*与对照腺病毒（Ad-CMV-Null）相比，P<0.05。
图5
图5
A类HMGA1的稳定沉默促进了吉西他滨的化疗敏感性体内裸鼠皮下模型有肿瘤消退的证据。小鼠（每组8只）皮下植入2X106慢病毒介导的稳定转染BxPC3细胞（shHMGA1或对照shRNA）。植入后14天，当肿瘤直径约为50mm时，每组开始接受吉西他滨治疗三体积。小鼠每周两次静脉注射吉西他滨（150 mg/kg）100μL PBS载体。在治疗的6周内，每周监测皮下肿瘤的大小。HMGA1沉默的肿瘤在治疗期间表现出体积缩小的迹象，而对照组的肿瘤则随着时间的推移继续生长。数值为平均值（±SD）*与对照shRNA异种移植物相比，P<0.05。B类图中显示了每组一只小鼠的代表性照片，肿瘤位于其侧翼。C类，显示了6周治疗期结束时的移植瘤。值得注意的是，shHMGA1组中的一只小鼠在6周吉西他滨治疗期间肿瘤完全消退。
图6
图6
A、 体内移植性异种肿瘤细胞核提取物的Western blot分析证实HMGA1沉默。密度值为平均值（±SD）*P=0.001与对照shRNA异种移植物的比较。B-C公司与HMGA1染色强烈的对照shRNA异种移植物相比，异种移植切片的免疫组织化学显示shHMGA1异种移生物中HMGA1几乎没有染色。放大40倍获得HMGA1染色的显微照片。在相同的切片中，进行TUNEL染色。在TUNEL染色的每张肿瘤玻片中，至少在5个随机选择的区域中以40倍放大率计数TUNEL阳性细胞的数量。与对照shRNA异种移植物相比，HMGA1沉默导致相对凋亡指数显著增加。图中显示了X20倍放大率下TUNEL染色的代表性肿瘤切片*与对照shRNA异种移植物相比，P<0.001。数值为平均值（±SD）。
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