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.2008年4月；10(4):452-9.
doi:10.1038/ncb1708。 Epub 2008年3月2日。

与加速衰老相关的成体干细胞的层粘连蛋白A依赖性失调

保拉·斯卡菲迪 1, 汤姆·米斯特利
附属公司

与加速衰老相关的成体干细胞的层粘连蛋白A依赖性失调

保拉·斯卡菲迪等。 Nat细胞生物学. 2008年4月.

摘要

早衰疾病Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome（HGPS）是由前体蛋白（核结构蛋白层粘连a的突变形式）的组成性生产引起的。前体蛋白也在野生型细胞中零星表达，并与生理衰老有关。HGPS患者的细胞表现出广泛的核缺陷，包括染色质结构异常和DNA损伤增加。在生物体水平上，HGPS影响多个组织，尤其是间充质来源的组织。HGPS细胞的细胞缺陷如何导致机体缺陷尚不清楚。在此，我们提供了前体蛋白干扰人类间充质干细胞（hMSCs）功能的证据。我们发现，前体蛋白的表达激活了Notch信号通路的主要下游效应器。hMSCs中前体蛋白的诱导改变了其分子特性和分化潜能。我们的结果支持一个模型，即HGPS患者的加速衰老，可能还有生理衰老，是成人干细胞功能障碍和组织功能逐渐恶化的结果。

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数字

图1
图1
激活Notch信号通路效应器以响应progrein(a）表达前体蛋白和野生型层粘连蛋白A的皮肤成纤维细胞中基因表达的时间依赖性变化。任一细胞系（1394个基因）中差异表达基因的标准化强度（≥2倍）绘制为相对于每个未诱导状态的时间函数。显示了每个样品的两个重复值。每个基因的颜色对应于10天时前体表达细胞的颜色。红色-橙色是上调基因，蓝色-灰色是下调基因。(b）热图表示基因的相对表达水平，在两种细胞系中的诱导差异至少为2倍。颜色表示在所有条件下每个基因强度范围的标准化值。在表达进展蛋白的细胞中，基因逐渐上调、逐渐下调或暂时上调或下调，以及野生型层粘连蛋白A表达细胞中的相应变化。(c–e类)表达水平的时间依赖性变化HES1型(c（c）),HES5型(d日)和TLE1级(e（电子）)在表达前体蛋白或野生型层粘连蛋白A的细胞中，如微阵列检测到的。数值代表两次生物复制的平均值±s。(（f）)表达水平的时间依赖性变化HES1型,HES5型和HEY1型在通过定量RT-PCR检测的进展表达细胞的诱导过程中。值被归一化为家务基因亲环素A星号表示与未感应状态相比存在统计显著差异(P（P）< 0.001). 数值表示两个生物复制的平均值±s.d。(克)在诱导前和使用抗HES1抗体去除强力霉素后4天对进展表达细胞进行免疫荧光显微镜检查。HES1的存在与GFP前体蛋白的表达相关。比例尺：20μm。
图2
图2
HGPS患者细胞中Notch信号通路效应器的激活。(一,b)定量RT-PCR分析HES1型和HEY1型四种不同HGPS细胞系和三种野生型对照细胞系的表达水平。值被归一化为家务基因环孢菌素A显示了两组细胞系之间差异的统计显著性。值表示至少两个实验的平均值±s.d。(c（c）)半定量RT-PCR分析HES5型四种不同HGPS细胞系和三种野生型对照细胞系的表达水平。每个样品分析两次，并用Syber Green检测产品。(d日)使用抗HES1和抗HP1γ抗体对HGPS细胞进行免疫荧光显微镜检查。HES1的存在与进展诱导的HP1γ减少相关（箭头）。比例尺：15μm。
图3
图3
孕激素改变hMSCs的分子和细胞特性。(a–d,克)使用所示抗体对表达GFP或GFP前体蛋白的未分化hMSCs进行免疫荧光显微镜检查。显示GFP信号（绿色）和抗体信号（红色）之间的合并。FITC–阴茎倍体蛋白与抗胶原蛋白IV一起用于显示细胞边缘。比例尺：20μm。(e（电子）,小时)内皮细胞表达水平的定量RT-PCR分析(e（电子）)和成骨(小时)未转导hMSCs和表达GFP、GFP-progrein或GFP-wt-lamin A的细胞中的标记物。表达GFP和未转导细胞之间差异的统计显著性由一个星号表示(P（P）< 0.05). 数值代表两个实验的平均值±s。d。(（f）)血管生成分析。将表达GFP–前体蛋白或未转导的未分化hMSCs在10 ng ml的基底膜提取物上培养−1h血管内皮生长因子。在电镀后的指定时间拍摄照片。比例尺：1 mm(j）表达GFP、GFP-前体蛋白或GFP-wt-lamin A或未翻译的未分化hMSC中分化标记物的量化。前体蛋白和野生型层粘连蛋白A表达细胞之间差异的统计意义由一个指标表示(P（P）<0.05）或两个(P（P）<0.0005）星号。600<N<800个单元。
图4
图4
表达进展蛋白的hMSCs分化潜能的改变。(一)通过茜素红染色检测表达GFP-前体蛋白或GFP-wt-lamin A的hMSCs中的矿化基质，或在成骨分化18天后未转染的hMSC中矿化基质。比例尺：150μm。(b)通过表达GFP、GFP-前体蛋白或GFP-wt-lamin A或在成骨分化18天后未转导的hMSCs定量分析钙沉积。数值代表三次生物复制的平均值±s。前体表达细胞和未转导或野生型层粘连蛋白A表达细胞之间的差异具有统计学意义。(c、 f、j)成骨细胞表达水平的定量RT-PCR分析(c（c）)，脂肪生成(（f），左侧面板）和软骨生成(j个)hMSCs中表达GFP、GFP-前体蛋白或GFP-wt-lamin A的标记物或分化3-5天和21天后未翻译的标记物。数值代表三个生物复制的平均值±s.d。中的右侧面板（f）显示荧光素酶分析测量PPARγ活性。数值代表三个生物复制的平均值±s.d。星号表示前体表达细胞和未转导细胞之间差异的统计意义(P（P）< 0.05). (d日)通过油红O染色检测表达GFP-前体蛋白或GFP-wt-lamin A的hMSCs中的脂滴或在脂肪分化19天后未转染的hMSC中的脂珠。显示GFP信号（绿色）和油红色O信号（红色）之间的合并。使用德克萨斯红过滤器观察到油红O。比例尺：40μm。(e（电子）)用异丙醇洗脱后加入的油红O的定量分析。数值代表三个生物复制的平均值±s.d。前体表达细胞和未转导或野生型层粘连蛋白A表达细胞之间的差异具有统计学意义。(克)Alcian Blue染色检测软骨颗粒中的糖胺聚糖，间接免疫荧光显微镜检测II型胶原。显示了胶原II染色（红色）和DAPI染色（蓝色）之间的融合。比例尺：500μm。(小时)定量分析软骨颗粒中II型胶原荧光信号，该颗粒来源于表达GFP、GFP前体蛋白或GFP-wt-lamin A的hMSCs或软骨形成23天后未表达的hMSC。数值代表三个不同截面的平均值±s.d。前体蛋白表达细胞与未转导或野生型层粘连蛋白A表达细胞之间的差异具有统计学意义。比例尺：40μm。
图5
图5
表达NICD-的hMSCs分化潜能的改变。(一)使用碱性磷酸酶（ALP）荧光底物和抗骨桥蛋白（OPN）抗体对未转导或表达NICD的未分化hMSCs进行免疫荧光显微镜检查。黄色晶体的存在表明表达NICD的hMSCs中的酶活性。在未转染的hMSCs中未检测到晶体。在未分化NICD-表达细胞中检测到高水平的细胞外骨桥蛋白，但在未转导细胞中未检测到。显示与DAPI信号合并（蓝色）。比例尺：10μm。(b,c（c）)分光光度法定量未分化hMSCs中碱性磷酸酶活性(b)和分化成骨细胞(c（c）). 数值代表三个生物复制的平均值±s.d。指出了差异的统计意义。(d日)成骨分化20天后通过表达NICD的hMSCs或未转染的细胞进行的钙沉积的定量分析。数值代表三个生物复制的平均值±s.d。指出了差异的统计显著性。(e（电子）)脂肪分化21天后，通过油红O染色观察表达NICD或未转导细胞的hMSCs中的脂滴。显示DAPI信号（蓝色）、GFP信号（绿色）和油红O信号（红色）之间的合并。油红O是使用德克萨斯红过滤器显示的。比例尺：10μm。(（f）)用异丙醇洗脱后加入的油红O的定量分析。数值代表三个生物复制的平均值±s.d。指出了差异的统计意义。
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