Acute kidney injury and aberrant planar cell polarity induce cyst formation in mice lacking renal cilia

doi:10.1093/hmg/ddn045

.2008年6月1日；17(11):1578-90.

doi:10.1093/hmg/ddn045。 Epub 2008年2月9日。

急性肾损伤和平面细胞极性异常诱导肾纤毛缺失小鼠囊肿形成

维沙尔·帕特尔¹, 凌莉, 帕特里夏·科博·斯塔克, 邵新立, 斯特凡·索姆洛, 林方明, 彼得·伊加拉西

附属机构

PMID： 18263895
预防性维修识别码： PMC3150596型
内政部： 10.1093/hmg/ddn045

急性肾损伤和平面细胞极性异常诱导肾纤毛缺失小鼠囊肿形成

维沙尔·帕特尔等。人类分子遗传学. 2008.

.2008年6月1日；17(11):1578-90.

doi:10.1093/hmg/ddn045。 Epub 2008年2月9日。

作者

维沙尔·帕特尔¹, 凌莉, 帕特里夏·科博·斯塔克, 邵新立, 斯特凡·索姆洛, 林方明, 彼得·伊加拉西

附属

¹美国德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心内科，邮编75390。

PMID： 18263895
预防性维修识别码： PMC3150596型
内政部： 10.1093/hmg/ddn045

摘要

多囊肾病（PKD）是一种遗传性疾病，其特征是肾实质内囊肿积聚，肾功能进行性下降。最近的研究表明，PKD是由原发纤毛异常引起的。我们之前已经证明，在胚胎发育过程中，致纤毛原基因Kif3a的肾特异性失活会导致肾囊肿和肾衰竭。在这里，我们使用他莫昔芬诱导的肾脏特异性基因靶向来灭活出生后小鼠肾脏中的Kif3a。新生小鼠Kif3a的肾脏特异性失活导致初级纤毛丢失，并主要在Henle环中产生肾囊肿，而成年小鼠的失活并没有导致囊肿的快速发展，尽管初级纤毛的损失相当。囊肿的年龄依赖性和位置表明，囊肿的形成需要增加细胞增殖率。为了测试这种可能性，我们通过诱导急性肾损伤和肾小管再生来刺激成人肾脏中的细胞增殖。Kif3a突变成年小鼠急性肾损伤诱导的囊肿形成。对Kif3a突变小鼠囊前小管的分析表明，纤毛的丢失不会刺激细胞增殖，而是导致细胞分裂方向异常所表现的平面细胞极性异常。我们的结论是，哺乳动物肾脏中维持平面细胞极性需要初级纤毛，急性肾损伤会加重囊性疾病。

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数字

**图1。**
Ksp/CreER的特性^T2段转基因小鼠。表达他莫昔芬诱导的Cre重组酶（CreER）的转基因小鼠^T2段)在Ksp-cadherin启动子（Ksp）的控制下生成。(A类)千磅/克当量^T2段小鼠与R26R-EYFP报告小鼠杂交，双转基因子代给予他莫昔芬（右）或载体（左）。用抗人类雌激素受体抗体（红色）染色肾切片显示CreER核易位^T2段他莫昔芬给药后的融合蛋白（箭头）。用DAPI对细胞核进行复染。用与EYFP（绿色）交叉反应的GFP抗体染色表明，报告基因仅在三苯氧胺处理的动物中通过Cre/loxP重组激活。比例尺：20µm。(B类)三苯氧胺处理的Ksp/CreER组织的免疫印迹分析^T2段;R26R-EYFP小鼠仅在肾脏中表达EYFP，表明Cre/loxP重组具有组织特异性（上图）。Ksp/CreER肾脏的免疫印迹分析^T2段;用三苯氧胺或载体治疗的R26R-EYFP小鼠显示Cre/loxP重组是三苯氧芬依赖性的（下表）。Ksp/Cre；R26R-EYFP小鼠肾脏作为阳性对照（+），Ksp/Cre小鼠肾脏作为阴性对照（-）。免疫印迹法结合抗微管蛋白抗体作为负荷对照。(C类)为了确定诱导Cre/loxP重组的肾单位片段，Ksp/CreER^T2段;R26R小鼠注射三苯氧胺，肾脏用抗β-半乳糖苷酶抗体（红色）和特异性肾单位片段标记物（绿色）共同染色。LTA、抗NKCC2、抗NCX1和抗AQP3染色显示*lacZ公司*分别在近端小管（pt）、Henle环厚升支（tal）、远端曲小管（dt）和集合管（cd）中表达。箭头表示共同本地化。比例尺：20µm。(D类)三苯氧胺诱导不同肾单位段Cre/loxP重组的效率。成人Ksp/CreER^T2段;R26R小鼠(n个=3）用三苯氧胺治疗5天，2周后取出肾脏，并用β-半乳糖苷酶抗体和特定肾单位片段标记物共同染色。直方图显示了*lacZ公司*-阳性细胞位于近端小管（pt）、Henle环厚升支（tal）、远端曲小管（dt）和集合管（cd）。误差条指示SD。

**图2。**
肾脏特异性失活*Kif3a型*P2导致原发性纤毛丢失并产生肾囊肿。有条件的*Kif3a型*突变小鼠（Ksp/CreER^T2段;*Kif3a型*^flox/−;R26R）和室友控制（Ksp/CreER^T2段;*Kif3a型*^{弗洛克斯/+};R26R和Ksp/CreER^T2段;*Kif3a型*^+/−;R26R）从P2到P4用三苯氧胺治疗，4周后进行分析。肾脏切片用X-gal染色以鉴定拉奇-三苯氧胺诱导Cre/loxP重组的阳性细胞。(A类)三苯氧胺治疗的对照小鼠的肾脏显示肾皮质（co）和髓质（me）的组织学正常。(B类)放大倍数较高的图像显示了*lacZ公司*在肾小管中。(C类)有条件的*Kif3a型*用三苯氧胺治疗的突变小鼠在皮质-延髓交界处附近出现肾囊肿（cy）。(D类)肾囊肿内衬*lacZ公司*-阳性上皮细胞。(E类和F类)为了确定囊肿的起源，用特定肾单位段的标记物对肾切片进行染色。DBA（绿色）和抗NKCC2抗体（红色）染色显示，囊肿起源于Henle（E）环和集合管（F）。(克和**H（H）**)通过乙酰化微管蛋白抗体（绿色）染色鉴定原发纤毛*lacZ公司*-阳性细胞通过与抗β-半乳糖苷酶抗体（红色）结合鉴定。（G）对照组肾脏的管腔表面有初级纤毛（箭头）*lacZ公司*-阳性肾小管上皮细胞。插图显示初级纤毛的高倍图像。（H）在*Kif3a型*突变的肾脏，纤毛从顶面（箭头）缺失*lacZ公司*-阳性囊肿上皮细胞。箭头表示相邻部位的纤毛*lacZ公司*-阴性非囊性小管。用DAPI对细胞核进行复染。比例尺：200微米（A和C）、50微米（B和D）、20微米（E和F）、10微米（H和I）。

**图3。**
出生后囊肿形成*Kif3a型*突变小鼠与细胞增殖相关。(A类)条件肾囊肿的起源*Kif3a型*突变小鼠。新生小鼠在P2至P4期间接受三苯氧胺治疗，4周后对肾脏进行切片并用DBA和抗NKCC2抗体染色。直方图显示源自母鸡收集管（cd）和环（tal）的囊肿百分比。误差条表示SD。*与tal有显著差异(*P（P）*<0.0001，学生t吨-测试，n个= 3). (B类)新生小鼠肾脏中的细胞增殖。野生型幼犬(n个=3）在P4时处死，肾切片用抗Ki-67抗体染色以标记增殖细胞。直方图显示了Henle（tal）和集合管（cd）粗大升支中Ki-67阳性细胞的百分比。误差条表示SD。*与tal有显著差异(*P（P）*=0.0002，学生的t吨-测试）。(C类)出生后肾脏发育期间细胞增殖下降。野生型小鼠(n个每个时间点=2–5）在不同年龄处死，肾脏切片用抗磷酸组蛋白H3抗体（H3pS10）染色，以鉴定有丝分裂细胞。直方图显示P1到P21中H3pS10阳性细胞的百分比。误差条指示SD。

**图4。**
肾脏特异性失活*Kif3a型*在成年小鼠中，尽管失去了初级纤毛，但不会产生肾囊肿。有条件的*Kif3a型*在P35给突变小鼠和对照鼠的窝友注射三苯氧胺，4周后分析肾脏。(A类和D类)对照组小鼠（A）和条件组小鼠的肾皮质（co）和髓质（me）的组织学均正常*Kif3a型*突变小鼠（D）。X-gal染色显示类似于*lacZ公司*在突变体（D）和对照（A）的肾小管中。(**B、 C、E、F**)为了鉴定初级纤毛，肾切片用乙酰化微管蛋白抗体染色（绿色）。*lacZ公司*-阳性细胞通过抗β-半乳糖苷酶抗体（红色）染色鉴定。（B和C）在对照肾脏中，初级纤毛（箭头）出现在*lacZ公司*-阳性肾小管上皮细胞。（E和F）在*Kif3a型*变异的肾脏，纤毛从顶部表面（箭头）消失*lacZ公司*-阳性的非囊性小管，但存在于邻近*lacZ公司*-阴性小管（箭头）。用DAPI对细胞核进行复染。比例尺：200µm（A和D）和10µm（B、C、E、F）。(克)直方图显示了拉奇-阳性细胞（阴影条）和*lacZ公司*-对照小鼠（左）和条件小鼠中含有初级纤毛的阴性细胞（实心条）*Kif3a型*突变小鼠（右）**P（P）*< 0.0001; NS，不显著(*P（P）*=0.22，学生的t吨-测试，n个= 3).

**图5。**
成人急性肾损伤刺激囊肿形成*Kif3a型*突变小鼠。有条件的*Kif3a型*在P35给突变小鼠注射三苯氧胺，并进行单侧肾脏IRI。2.5周后对肾脏进行分析。(A类和B类)未受损肾脏的X-gal染色显示组织学正常。高倍图像显示*lacZ公司*-阳性细胞存在于非囊性小管（B）中。(**C–E类**)受伤的肾脏含有多个囊肿（cy），这些囊肿由*lacZ公司*-阳性上皮细胞。(F类和克)用Abs对乙酰化微管蛋白（绿色）和β-半乳糖苷酶（红色）进行共培养，结果表明：*lacZ公司-*阳性细胞构成未受损肾脏（F）的非囊性小管以及受损肾脏（G）的囊性上皮。Cilia出现在*lacZ公司*-阴性小管（箭头）。比例尺：200微米（A、C、D）、20微米（B和E）、10微米（F和G）。(**H（H）**)显示条件下囊肿指数的直方图*Kif3a型*突变小鼠在P35用三苯氧胺治疗，并接受单侧肾脏IRI或假手术。

**图6。**
肾特异性囊肿形成前纤毛缺失*Kif3a型*突变小鼠。为了研究纤毛脱落后囊肿形成的机制，*第1页*/Cre；*Kif3a型*^{弗洛克斯/−};生成R26R小鼠。(A类)来自21天大对照同窝出生的配偶的肾脏的H&E染色（Pkhd1/Cre；*Kif3a型*^+/−;R26R）显示正常组织学，而*第1页*/Cre；*Kif3a型*^flox/−小鼠有许多囊肿，主要位于肾髓质(D类). (B类)X-gal染色显示*lacZ公司*在对照肾的集合管中表达。(E类)在*第1页*/Cre；*Kif3a型*^flox/−肾脏，囊肿（cy）由*lacZ公司*-经过Cre/loxP重组的阳性细胞。(C类)与DBA（红色）和抗乙酰化微管蛋白抗体（绿色）的协同训练表明，对照肾脏的集合管中存在纤毛（箭头）。(F类)在Pkhd1/Cre；*Kif3a型*^flox/−肾脏，囊肿（cy）经DBA染色，表明囊肿起源于集合管，但不含纤毛。为了确定纤毛的丢失是否先于囊肿的形成，Pkhd1/Cre的肾脏；*Kif3a型*^flox/−在囊肿形成之前，在P7-10对小鼠进行检查。(**G–I型**)用DBA（红色）和抗乙酰化微管蛋白抗体（绿色）对肾脏进行染色，结果表明，对照小鼠的集合管中存在纤毛，但在Pkhd1/Cre的囊前集合管中没有纤毛；*Kif3a型*^flox/−老鼠(**J–L型**). 比例尺：100微米（A和D）、50微米（B和E）、10微米（C、F、G–L）。

**图7。**
肾纤毛的丢失不会刺激细胞增殖，但会产生异常的平面细胞极性。(A类)Ki-67阳性细胞的定量*lacZ公司*-对照组小鼠（阴影条）和Pkhd1/Cre的阳性肾小管；*Kif3a型*^flox/−P7–P10小鼠（实心棒）的细胞增殖率无显著差异。NS，不显著(*P（P）*=0.92，学生的t吨-测试，n个= 3). 误差条指示SD(B类)为了确定纤毛的缺失是否产生异常的平面细胞极性，以Pkhd1/Cre测量细胞分裂的方向；*Kif3a型*^flox/−在囊肿形成之前的P7–P10小鼠。用针对磷酸组蛋白H3（绿色）和戊聚糖（红色）的Abs染色的肾脏的代表性图像显示，在来自对照小鼠（左）的收集管中，细胞分裂（系）的方向平行于小管的纵轴，但在Pkhd1/Cre中不平行；*Kif3a型*^flox/−老鼠（右）。(C类)显示对照小鼠（阴影条）和Pkhd1/Cre中有丝分裂纺锤体定向分布的直方图；*Kif3a型*^flox/−老鼠（实心棒）。在Pkhd1/Cre中，细胞分裂的方向更加随机；*Kif3a型*^flox/−老鼠(*P（P）*=0.0004，曼·惠特尼U型测试，n个= 82).

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[2] Igarashi P.，Somlo S.多囊肾病的遗传学和发病机制。《美国肾脏学会杂志》。2002;13:2384–2398.-公共医学

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