跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

政府意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府网站。

Https公司

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2008年3月；19(3):455-68.
doi:10.1681/ASN.2007070770。 Epub 2008年1月30日。

纤维细胞蛋白/聚管道蛋白通过调节多囊蛋白-2的表达和功能调节肾小管的形成

金英宇 1, 玉龙府, 观音会, 吉尔伯特·默克尔, 卫一麦, 存西里, Dan Liang（梁丹）, 赵萍（Ping Zhao）, 马杰, 陈兴珍, 阿尔弗雷德·乔治, 罗伯特·J·科菲, 钟平锋, 吴冠清
附属公司

纤维细胞蛋白/聚管道蛋白通过调节多囊蛋白-2的表达和功能调节肾小管的形成

Ingyu Kim公司等。 J Am Soc肾病. 2008年3月.

摘要

常染色体隐性多囊肾病是由PKHD1基因突变引起的，PKHD1编码膜相关受体样蛋白纤维胱氨酸/多导蛋白（FPC）。FPC与上皮细胞的初级纤毛结合，并与Pkd2基因产物多囊蛋白-2（PC2）共同定位，这表明这两种蛋白质可能在一个共同的分子途径中发挥作用。为了研究这一点，我们制作了一个Pkhd1基因靶向突变的小鼠模型，该模型再现了人类常染色体隐性遗传多囊肾病的表型特征。FPC的缺失与Pkhd1缺乏小鼠肾脏中异常纤毛生成有关。研究发现，FPC的COOH末端和PC2的NH2末端相互作用，缺乏FPC会降低PC2的表达，但反之亦然，这表明PC2可能在体内紧靠FPC下游发挥作用。来自Pkhd1突变小鼠的培养肾上皮细胞中PC2通道活性失调，进一步支持了两种胱蛋白酶在共同途径中发挥作用。此外，与单突变小鼠相比，Pkhd1和Pkd2突变小鼠的肾囊性表型更为严重，这表明FPC在Pkd2突变导致的常染色体显性多囊肾病中作为疾病严重程度的遗传修饰物。结论是FPC和PC2在体内存在功能和分子相互作用。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
第1页基因靶向结构和特定靶向事件的分子分析第1页轨迹。（A） 基因定位策略的示意图。（一） 显示第15至21外显子的部分基因组图第1页（二）第1页e15GFP（电子15GFP）Δ16其中外显子16被删除并且外显子15被破坏的靶向载体。（三） 突变体的部分图谱第1页等位基因。Nh，NheI；S、 SphI；P、 PstI；B、 巴米希；K、 肯尼亚。（B） 种系靶向突变小鼠尾部活检DNA第1页用PstI消化，并与来自靶区（AIII）外的探针1杂交。在WT和第1页杂合小鼠。在第1页杂合和纯合小鼠。（C） 尾部活检DNA用BamHI消化，并与第1页第16外显子探针。放射性信号在第1页纯合子小鼠。（D） 一个3.8 kb的cDNA片段，包含第1页作为北方探测器探测第1页在成人肾脏总RNA中。第1页−/−小鼠表现出缺乏第1页mRNA（D，顶部）。28S rRNA带图像提供了总RNA负载控制（D，底部）。（E） 因为第1页突变等位基因包含一个框架内GFP报告基因，我们使用抗GFP抗体检测GFP的表达。GFP免疫反应在成年大鼠肾脏中的预期大小为130 kD第1页−/−和第1页+/−老鼠。（F） FPC的Western blot检测。分别识别FPC的COOH和NH2部分的抗体hAR-Cm3C10和hAR-Nm3G12用于检测WT成人肾脏对FPC的免疫反应，第1页+/−、和第1页−/−老鼠。FPC表达在第1页−/−肾脏与WT和第1页+/−.
图2。
图2。
生存分析第1页突变小鼠。（A） 基因型和存活率第1页从胚胎到成年的突变小鼠。（B） WT的Kaplan-Meier生存曲线，第1页+/−、和第1页−/−展示的是老鼠。对这些队列中的小鼠进行了>1年的观察第1页−/−小鼠与WT和第1页+/−队列(P（P）< 0.001).
图3。
图3。
肝肾囊肿和肾小管扩张第1页−/−老鼠。（A） 肾组织切片显示2周龄WT小鼠的正常肾小球和正常肾小管间质室。（B） 近端小管片状扩张和乳头状集合管局灶性扩张见于第1页−/−室友。（C） 4周大的孩子肾小管扩张程度显著增加，小管上皮细胞变平（箭头所示）第1页−/−鼠标。（D） 2个月时，皮质近端小管和髓质集合管小管的肾小管扩张程度进一步增加。此外，鲍曼间隙扩大（箭头所示），系膜细胞增多，肾小球毛细血管环形成减少。（E） 4个月时，整体第1页−/−肾小管扩张显著增加，涉及80%以上的皮质和髓质。（F） 肾皮质区E的高倍视野显示Bowman间隙持续扩张，肾小球大小和节段性系膜高细胞性轻度下降。近端小管扩张。（G） E高倍视野的髓质切片也偶尔显示由单层上皮衬里的小囊肿。管腔内可见红细胞。（H） 肝脏切片显示2周龄WT小鼠的组织学正常。（一） 纯合子同胞的肝脏切片显示胆管扩张。（J） 2个月龄受影响肝脏的透照第1页−/−小鼠出现囊肿形成（左箭头）和导管扩张（右箭头）。（K） 同一只小鼠的肝实质内有局部扩大的囊肿，有出血和坏死区域（箭头所示）。A、B、H和I中的Bar=20μm；C、D、F、G和K中为10μm；E和J中为1 mm。
图4。
图4。
在肝外肾器官中发现异常表型第1页−/−老鼠。（A） 6个月龄WT小鼠的胰腺切片显示组织学正常。（B） 在同一同卵同卵双胞胎中，大小胰管均扩张（上箭头），间质纤维化显著增加（下箭头）。（C） 2个月龄WT小鼠的正常脑切片。（D） 脑组织切片显示纯合子同卵双胞胎中有多个弥漫的中小型液泡（箭头所示）。（E） 一只2个月大纯合小鼠的胃粘膜出现溃疡性病变（箭头所示），边缘呈串珠状。（F） 同一只小鼠的结肠显示出小面积的浆膜下出血。（G） 2月龄纯合子小鼠结肠的粘膜表现为溃疡性小病灶伴出血（箭头所示）。（H） G组标本的结肠镜下切片显示粘膜下淋巴细胞浸润，并伴有局部坏死和上覆上皮糜烂。（一） 小肠粘膜的大体视图，有轻微的表面出血（箭头所示）。I中样本的组织学切片显示粘膜下水肿、淋巴细胞浸润、出血和上覆粘膜侵蚀。A至D中的Bar=25μm；H中为5μm；E至G和I中为1 mM；和10μm in I inset。
图5。
图5。
GFP在第1页突变小鼠。（A） 图15.5第1页−/−使用抗GFP多克隆抗体用IHC对肾脏、肝脏、肾上腺和胃肠道进行染色。肾上腺皮质细胞（左箭头）、门脉周围肝细胞（右箭头）、胃肠道（白盒）呈阳性信号，肾小管（黑盒）呈弱阳性染色。（B） 高倍放大A中的黑盒显示肾上皮染色阳性（箭头所示）。（C） A中白盒的放大倍数越高，结肠粘膜细胞中的染色越强（箭头）。（D） 差异界面对比图显示4个月龄的肾小管上皮中GFP阳性染色（箭头）第1页+/−（D，顶部）和第1页−/−（D，底部）室友。（E） 2月龄纯合子小鼠肺泡细支气管中检测到GFP阳性染色（箭头所示）。（F） 同一只小鼠的气管上皮也可见GFP阳性（箭头所示）。（G） 2月龄纯合子小鼠脑室内室管膜细胞出现GFP阳性染色（红色）（箭头所示）。用Yo-pro（绿色）染色细胞核。（H） 在2个月龄纯合小鼠的病肝中观察到GFP阳性染色（红色）（箭头所示）。（一） 细胞角蛋白7阳性染色（绿色）是上皮细胞的标记，勾勒出胆道上皮结构（箭头）。（J） 合并的共焦图像显示GFP与细胞角蛋白7共定位。Bar=30μm（单位：A）；B和C中为15μm；在D到J中为10μm。
图6。
图6。
缺乏FPC会导致第1页−/−肾脏。（A） 一种常见的睫状体标记物，抗乙酰化α-微管蛋白抗体，用于6个月龄WT和第1页−/−室友。在WT肾脏中观察到大量纤毛结构（箭头）。（B） 睫状体染色减少（箭头）见于第1页−/−小鼠肾脏。（C） 共聚焦图像还显示4个月龄WT肾脏的正常睫状结构（箭头所示）。用莲花凝集素（绿色）染色肾近端小管。（D） 睫状体结构第1页−/−与WT对照组相比，窝友数量减少且更短（箭头所示）。（E） 扫描电子显微镜显示3个月龄WT肾脏的正常初级纤毛（箭头）。（F） 睫状体结构第1页−/−在肾脏的类似区域，肾脏比WT同窝雌鼠的肾脏短。（G） 来自2个月龄WT和第1页−/−肾脏用抗乙酰化α-微管蛋白抗体染色。共焦图像显示正常的睫状体结构（箭头）在顶部（G，顶部）和侧面（G，底部）。蓝色To-pro用于染色细胞核。（H） 在原代培养的上皮细胞中第1页−/−共聚焦图像显示，与对照细胞相比，睫状体结构更短，数量更少（箭头所示）。共聚焦俯视图和侧视图由多个截面组成（约0.5μm厚，最多16层），投影到一个平面上以呈现睫状体染色模式。（一） 对来自5个随机高功率场（×1000）的100个原代培养细胞进行编号；细胞数量和阳性纤毛染色率如I所示。在WT细胞中，94%的细胞纤毛染色阳性，而第1页−/−窝卵细胞(P（P）< 0.001). （J） 利用共焦图像的侧视图测量了来自三个随机高功率场的培养细胞的50根初级纤毛的长度；计算初级纤毛的平均长度并以J表示。初级纤毛长度在WT中约为10μm，在第1页−/−窝卵细胞(P（P）< 0.005). A至D中的Bar=10μm；E和F中为2μm；G和H中为5μm。
图7。
图7。
小鼠的囊性表型反式-突变体第1页和第二页（A）在一个具有代表性的苏木精和伊红染色切片中，在1个月龄的大鼠中发现了球形肾囊肿（箭头所示；直径>50μm被视为肾囊肿）第1页−/−/第二页+/−双突变小鼠。（B） 四种基因型在1个月龄时的囊肿数量以平均值±标准差表示(n个=每组动物的数量）。球形肾囊肿的增加第1页−/−/第2页+/− 反式-突变小鼠显著高于其他基因型(*P（P）< 0.05). （C） 蛋白质裂解物的Western blot第二页+/−1个月大的小鼠肾脏，有或没有第1页−/−使用抗PC2抗体hPKD2-Cm1A11进行突变。溶血物的免疫反应性显著降低第1页−/−突变小鼠表明缺乏FPC会降低PC2的表达体内.Bar=30μm（单位：A）。
图8。
图8。
FPC和PC2之间的分子关系。（A） 使用WT重复蛋白裂解物的抗PC2单克隆抗体hPKD2-Cm1A11的Western blot，第1页+/−、和第1页−/−E13.5窝友的PC2表达显著下调第1页−/−胚胎，表明缺乏FPC会抑制PC2的表达体内抗β-肌动蛋白抗体用于蛋白质负荷控制。（B） 与WT窝友（左）相比，用抗PC2多克隆抗体hPKD2-Cp进行IHC染色显示，1月龄大鼠皮层区域PC2表达显著降低第1页−/−肾脏（右）。（C） E13.5 WT的重复裂解产物，第1页+/−、和第1页−/−使用抗FPC抗体hAR-Nm3G12对IP和抗PC2抗体hPKD2-Cm1A11检测PC2的表达，让窝友进行co-IP Western。WT胚胎中可见阳性免疫反应，而WT胚胎的免疫反应逐渐减弱第1页+/−和第1页−/−室友，表明FPC与PC2结合体内.（D）E13.5 WT的裂解产物，第二页+/−、和第二页−/−利用抗PC2抗体和抗FPC抗体检测FPC的表达，让同窝婴儿进行co-IP Western。WT和第二页+/−同窝，但在第二页−/−室友，进一步证明FPC与PC2有物理交互作用体内（E）在Western blot分析中，WT和第二页−/−这表明PC2的下调并不影响FPC的表达。（F） 将HA和Flag标记的表达载体瞬时共转染到HEK293细胞中，其中FPC的COOH末端（FPC-C-Flag）和PC2的NH2末端（PC2-N-HA）构建在框架内。用IP的抗Flag抗体和抗HA抗体检测PC2的NH2末端，仅在共转染样品中观察到阳性免疫反应，表明FPC的COOH末端与PC2的NH2末端发生物理相互作用在体外（G）将相同的FPC-C-Flag表达载体与含有人类全长的表达载体瞬时共转染到HEK293细胞PKD2系列cDNA（PC2-Full）。抗PC2抗体hPKD2-Cm1A11用于IP，抗Flag抗体用于检测FPC的COOH末端。仅在联合转染的样品中观察到强阳性免疫反应，在FPC-C-Flag单转染样品中检测到弱免疫反应，表明外源性转染或内源性表达的带有FPC-C-Flag构建物的PC2免疫沉淀物。这进一步证实了FPC的COOH末端与PC2的NH2末端发生物理相互作用。（H） 使用针对FPC COOH末端的hAR-C2p抗体与FPC-C-Flag单转染蛋白裂解物预培养，仅在未预培养的co-IP样品中观察到阳性免疫反应，而在预培养的co-IP样品上则没有免疫反应。Bar=30μm in B。
图9。
图9。
全细胞电流记录分析第1页-缺乏细胞。（A） E13.5胚胎原代培养成纤维细胞的平均电流密度（pA/pF）和电压关系（I-V曲线）在WT和第二页−/−室友，表明阳离子通道活性是由PC2缺乏引起的(n个= 10; *P（P）< 0.005). （B） A类第1页-敲除稳定细胞系IMCDshRNA3e23及其WT控制的细胞系IMCD第15页用于在相同条件下进行全细胞电流记录分析。电流是通过从0 mV的保持电位步进到各种测试电位（Ba）而产生的。IMCD之间的电流密度shRNA3e23(n个=12）和IMCD第15页(n个=7）细胞表现出统计显著差异（Bb与Bc*P（P）< 0.001). 控制IMCD第15页细胞显示出陡峭的内向整流电流，通过胞内引入抗PC2 C末端抗体hPKD2-Cp可显著降低内向整流电流通过1:200稀释度的移液管溶液(n个= 8; Bb公司与Be#P（P）<0.02），表明当前变化是PC2特有的。（C） 来自2个月龄WT（WT）和第1页−/−同窝婴儿被用来进行相同的全细胞电流记录分析。控制WT单元(n个=15）显示出陡峭的内向整流电流，在第1页−/−单元格(n个= 7). 这表明第1页−/−小鼠的体重明显低于WT同窝小鼠(*P（P）< 0.003). （D） 将hPKD2-Cp和阴性对照抗肌动蛋白抗体分别加入到单独的WT细胞中通过移液管溶液。具有抗肌动蛋白抗体的细胞中代表性电流痕迹没有明显减少(n个=6），但在具有hPKD2-Cp抗体的细胞中可以看到明显较小的电流振幅(n个= 8; #P（P）<0.01），进一步表明WT和巴基斯坦卢比2−/−C中的单元格是第二页具体而言。（E） 为了明确验证第1页−/−细胞是由于缺乏FPC表达PKHD1系列将cDNA构建到GFP标记的表达载体中，并瞬时转染到第1页−/−细胞。选择GFP阳性细胞进行全细胞电流记录(n个=4），电流密度-电压曲线图显示FPC的重新表达拯救了在第1页−/−单元格(第1页−/−-C类与Pkhd1−/−; #P（P）< 0.01). 虚线表示从第1页−/−C中的电池，虚线显示了C中WT电池的平均I-V曲线。在跨入测试电势后220ms测量电流。数据为受试独立电池的平均值±SEM。受试细胞组在*+80和#+100 mV时的统计差异。数据用标准波尔兹曼方程拟合（I=I最大值/1−e（V50−V）/k）+C）。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

中的注释

  • ARPKD和ADPKD：堂兄妹还是远亲？
    Kaimori JY，Germino GG。 Kaimori JY等人。 《美国肾脏病杂志》。2008年3月；19(3):416-8. doi:10.1681/ASN.200801033。Epub 2008年2月13日。 《美国肾脏病杂志》。2008 PMID：18272839 没有可用的摘要。

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Igarashi P，Somlo S：多囊肾病的遗传学和发病机制。美国社会学杂志肾病13:2384–23982002-公共医学
    1. Wilson P：多囊肾病。《新英格兰医学杂志》350:151–1642004-公共医学
    1. Torres VE，Harris PC：疾病机制：常染色体显性和隐性多囊肾疾病。Nat Clin Pract Nephrol 2:40–55，测验552006-公共医学
    1. Mochizuki T、Wu G、Hayashi T、Thenonontos SL、Veldhuisen B、Saris JJ、Reynolds DM、Cai Y、Gabow PA、Pierides A、Kimberling WJ、Breuning MH、Deltas CC、Peters DJ、Somlo S:PKD2，一种编码完整膜蛋白的多囊肾病基因。科学272:1339–13421996-公共医学
    1. Sutters M，Germino GG：常染色体显性多囊肾病：分子遗传学和病理生理学。《临床医学实验室杂志》141:91–1012003-公共医学

出版物类型

MeSH术语