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.2008年5月；47(5):1495-503.
doi:10.1002/hep.22183。

游离脂肪酸诱导肝脂毒性中的溶酶体-线粒体轴

李郑正 1, 迈克尔·伯克, 托马斯·麦金太尔, 格雷戈里·戈尔斯, 阿里尔·费尔德斯坦
附属公司

游离脂肪酸诱导肝脂毒性中的溶酶体-线粒体轴

李正政等。 肝病学. 2008年5月.

摘要

线粒体功能受损在很大程度上被认为是非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）疾病进展的核心异常。然而，导致NAFLD线粒体功能障碍的分子机制尚不清楚。本研究探讨了肝细胞中游离脂肪酸（FFA）过度积累对线粒体功能的影响以及溶酶体-线粒体轴在脂肪毒性中的作用。用不同浓度的不同饱和度的FFA处理小鼠原代肝细胞HepG2和McNtcp.24细胞长达24小时。通过实时成像、细胞色素c重新分布和活性氧（ROS）生成监测线粒体功能。建立了溶酶体和线粒体通透性的时间关系。溶酶体蛋白酶组织蛋白酶B的活性受到遗传和药理学方法的抑制。组织蛋白酶B基因敲除小鼠和野生型动物接受高碳水化合物饮食16周，并评估线粒体功能和肝脏损伤。肝细胞暴露于饱和FFA导致线粒体去极化、细胞色素c释放和ROS生成增加。溶酶体通透性和组织蛋白酶B重新分布到细胞质发生在线粒体功能障碍前几个小时。组织蛋白酶B的药理或基因抑制都能保护线粒体功能。最后，组织蛋白酶B失活保护线粒体，减少氧化应激，减轻体内肝损伤。

结论：这些数据强烈表明，饱和FFA在肝细胞中的过度积累直接导致线粒体功能障碍和氧化应激。我们的数据进一步表明，这一过程依赖于溶酶体的破坏和组织蛋白酶B的激活。

PubMed免责声明

数字

图1
图1
游离脂肪酸（FFA）诱导的剂量和饱和度依赖性线粒体功能障碍。将C57BL/6小鼠分离的肝细胞在有或无不同浓度的饱和程度的FFA的情况下培养24小时。（A） 线粒体通透性通过四甲基罗丹明甲酯（TMRM，549/573 nm）染色测定，四甲基罗达明甲酯是一种线粒体选择性染料，在未固定活细胞中线粒体去极化后释放，并在荧光显微镜下观察。（B） 用0.2 mM的各种FFA处理细胞6小时。用洋地黄素选择性渗透制备细胞溶胶组分。细胞溶胶蛋白通过SDS-PAGE凝胶溶解，转移到硝化纤维素中，并探测细胞色素c。β-肌动蛋白起到控制蛋白质负荷的作用。（C） 免疫荧光法进一步研究了细胞色素C的亚细胞定位。细胞固定，并在室温下与抗细胞色素c抗体（1:100稀释）孵育1小时。（D） 最后，使用非荧光细胞发酵剂化合物2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）监测FFA过度积累对肝细胞ROS生成的影响。该技术基于这样的原理，即在被ROS氧化时，该化合物的去酯化形式变成荧光化合物二氯荧光素（DCF）。FFA处理的细胞负载10μM的DCFH-DA（分子探针）在37°C的KRH缓冲液中放置30分钟。使用倒置荧光显微镜在单细胞水平监测荧光化合物DCF。
图2
图2
FFA诱导溶酶体通透性下游的线粒体去极化和细胞色素c释放以及组织蛋白酶B激活。（A） 用或不用0.2 mM FFA培养细胞6小时。通过在未固定的活细胞中用LysoTracker Red（LTR）和四甲基罗丹明甲酯（TMRM）染色来确定FFAs诱导的溶酶体和线粒体透化的时间过程，并在荧光显微镜下观察。数值表示0小时时的平均荧光百分比。结果表示为每个治疗组和3个独立实验中15到30个细胞的平均值±SE(*P（P）与基线时的荧光相比，<0.05。（B） 用或不用0.2 mM FFA培养细胞6小时。通过对细胞溶质组分的免疫印迹分析，研究组织蛋白酶B和细胞色素c重新分布到细胞质中的时间过程，详见材料和方法一节。
图3
图3
组织蛋白酶B抑制可减少FFA诱导的细胞色素c释放。在组织蛋白酶B选择性抑制剂（CA074；20）存在或不存在的情况下，用0.2 mM FFA处理HepG2细胞μM） 持续6小时。星孢霉素（STS；3μM） 作为阳性对照。（A） 用洋地黄素选择性渗透制备细胞溶胶组分。细胞溶胶蛋白通过SDS-PAGE凝胶溶解，转移到硝化纤维素中，并探测细胞色素c。β-肌动蛋白作为蛋白质负载的对照。（B） 免疫荧光法进一步研究了细胞色素c的亚细胞定位。细胞固定，并在室温下与抗细胞色素c抗体（1:100稀释）孵育1小时。
图4
图4
FFA以组织蛋白酶B依赖性的方式诱导线粒体膜电位损失。在组织蛋白酶B选择性抑制剂（CA074）存在或不存在的情况下，用或不使用FFA培养细胞6小时。星孢霉素（STS；3μM） 作为阳性对照。（A） 如前所述，通过TMRM荧光实时成像测量线粒体跨膜电位。（B） 数值表示在控制条件下以荧光百分比表示的平均荧光。结果表示为每个治疗组和3个独立实验中15到30个细胞的平均±SE。
图5
图5
组织蛋白酶B siRNA有效抑制HepG2细胞中的组织蛋白酶B。HepG2细胞中组织蛋白酶B的表达被siRNA沉默，详见材料和方法一节。用组织蛋白酶B siRNA转染HepG2细胞后，（A）对Bax和β-进行肌动蛋白测定，并使用组织蛋白酶B活性测定测定组织蛋白酶B活性，详见材料和方法部分(*P（P）<与对照组比较0.01；组织蛋白酶B；Scr.、。，争夺；小干扰RNA。
图6
图6
组织蛋白酶B的遗传抑制保护线粒体功能。用组织蛋白酶B或干扰siRNA转染48小时后，用棕榈酸酯处理细胞6小时。（A） 用洋地黄素选择性渗透制备细胞溶胶组分。细胞溶胶蛋白通过SDS-PAGE凝胶溶解，转移到硝化纤维素中，并探测细胞色素c。β-肌动蛋白起到控制蛋白质负荷的作用。（B） 用免疫荧光法研究细胞色素c的亚细胞定位。细胞固定，并在室温下与抗细胞色素c抗体（1:100稀释）孵育1小时。
图7
图7
Ctsb公司−/−动物受到保护，免受饮食诱导的线粒体功能障碍和肝损伤。组织蛋白酶B–敲除（ctsb−/−)小鼠及其野生型对照（ctsb+/+)接受高碳水化合物饮食16周。（A） H&E染色的代表性显微照片。（B） 4组小鼠肝脏FFA含量。（C） 细胞溶质细胞色素C的免疫印迹(β-肌动蛋白起到控制蛋白质负荷的作用）。（D） 肝切片中氧化应激的代表性脂质过氧化产物4-羟基壬醛（4-HNE）的免疫组织化学研究−/−和ctsb+/+控制饮食或高碳水化合物饮食的动物。（E） 4组小鼠的血清ALT水平。
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