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.2008年3月；19(3):587-92.
doi:10.1681/ASN.2007040490。 Epub 2008年1月16日。

NEK8突变影响睫状体和中心体的定位，并可能导致肾结石

埃德加·A·奥托 1, 梅利莎·L·特拉普, 乌拉·T·舒尔特海斯, 朱莉安娜·赫鲁, Lynne M Quarmby公司, 弗里德海姆·希尔德布兰特
附属公司

NEK8突变影响睫状体和中心体的定位，并可能导致肾结石

埃德加·A·奥托等。 J Am Soc肾病. 2008年3月.

摘要

肾病综合征是一种常染色体隐性遗传的肾脏疾病，是生命前30年慢性肾功能衰竭最常见的遗传原因。已确定8个基因（NPHP1-8）的致病突变，并描述了NPHP2/INVS和NPHP3的同源小鼠模型。jck小鼠是另一种隐性囊性肾病模型，该小鼠在Nek8高度保守的RCC1结构域中含有一个错义突变G448V。我们假设NEK8基因突变可能导致人类肾病，因此我们对全球588名患者进行了突变分析。我们确定了3种不同的氨基酸变化，这些变化在进化过程中保持不变（L330F、H425Y和A497P），并且在至少80个种族匹配的对照组中缺失。所有3个突变均位于RCC1结构域内，突变H425Y与小鼠jck突变位于相同的RCC1重复序列内。为了测试这些突变的功能意义，我们将它们引入到全长小鼠Nek8 GFP标记的cDNA结构中。我们在髓内收集管细胞（IMCD-3细胞系）中瞬时过表达了构建体，并比较了突变体Nek8和野生型Nek8的亚细胞定位。Nek8的所有突变型都不同程度地存在睫状体定位缺陷；H431Y突变体（人类H425Y）在纤毛中完全缺失，定位于中心体的数量减少。这些突变体的过度表达并不影响纤毛发生、有丝分裂或中心粒数量。我们的遗传和功能数据支持NEK8突变导致肾单位瘤（NPHP9）的假设，这在囊性肾病中突变的蛋白质及其定位于纤毛和中心体之间增加了另一个联系。

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数字

图1。
图1。
人类NEK8突变与进化保护。（A） 3种不同的色谱图NEK8公司在3名肾病患者中检测到突变。家族号、氨基酸序列变化和突变核苷酸在上述序列追踪中给出。野生型序列如下所示。阅读框由上方面板中的密码子三联体下划线表示，突变的核苷酸由箭头表示。这两个突变L330F和A497P发生在杂合状态，H425Y发生在纯合状态。至少80名健康对照个体没有出现所有突变。（B） 不同物种同源物患者中突变区域的Nek8蛋白序列的比对。属于同一化学基团的氨基酸残基以相同的颜色编码。突变氨基酸用箭头表示。氨基酸序列与智人（H.s.），小家鼠（百万），热带爪蟾（X.t.），达尼奥·雷里奥（D.r.），以及肠蝉（C.i.）。
图2。
图2。
（A） GFP标记的Nek8构建体的差异亚细胞定位的量化。对瞬时转染的低到中等表达水平的纤毛化、单核IMCD-3细胞进行GFP-突变体Nek8纤毛、中心体、核周和细胞外周定位的定量。单独GFP、野生型（WT）、L336F、H431Y和A503P的3个独立实验计数的细胞总数分别为45、50、55、55和45。误差杆=SEM。注意，与野生型相比，突变结构体L336F和H431Y的睫状体定位显著降低。突变体H431Y的中心体定位显著降低。假设两样本不相等方差具有双尾概率，使用T检验评估统计显著性*P（P）= 0.01, **P（P）< 0.001. （B） Nek8的过度表达对纤毛生成没有影响。转染细胞和未转染细胞被分为纤毛有一对中心粒、纤毛缺乏有一对中间粒、有丝分裂、多核或中心粒数量异常，包括完全没有。n=三个独立实验计数的细胞总数。未转染、GFP单独、WT、L336F、H431Y和A503P的三个独立实验计数的细胞总数分别为1095、150、300、250、300和258。误差线=SEM。
图3。
图3。
Nek8突变型在亚细胞定位方面存在缺陷。N-末端GFP标记的小鼠Nek8 cDNA在内髓集合管（IMCD-3）细胞中的短暂过度表达。（A） 对细胞进行抗乙酰化微管蛋白（红色）染色，以显示纤毛（箭头）和抗γ-微管蛋白，以标记中心体（箭头），DAPI标记细胞核（蓝色）。野生型GFP-Nek8（绿色）定位于细胞质、中心体（箭头）和纤毛（箭头）。（B至E）GFP单独表达和突变GFP-Nek8结构。注意，小鼠的氨基酸编号不同墨西哥湾8和人类NEK8公司（表1）。固定细胞，并对纤毛进行抗乙酰化微管蛋白染色（红色），对中心体进行抗γ-微管蛋白（蓝色）和DAPI（蓝色）染色。（B） GFP仅定位于细胞质，而不定位于纤毛或中心体。（C） GFP-L336F-Nek8突变体在细胞质和中心体中检测到，但在纤毛中未检测到。（D） 在本例中，GFP-H431Y-Nek8突变与中心体或纤毛均无关。（E） GFP-A503P定位于细胞质和中心体，但在本例中不定位于纤毛。插图在面板B和D中为×2原始放大倍数，在面板C和E中为×1.5放大倍数。
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