Metabolic basis of visual cycle inhibition by retinoid and nonretinoid compounds in the vertebrate retina

doi:10.1074/jbc.M708982200

.2008年4月11日；283(15):9543-54.

doi:10.1074/jbc。M708982200。 Epub 2008年1月14日。

脊椎动物视网膜中维甲酸和非维甲酸化合物抑制视觉周期的代谢基础

马尔金·戈尔扎克¹, 前田昭子, Grzegorz贝雷塔, 前田忠道, 菲利普·D·基瑟, 希尔克·亨泽尔曼, 约翰内斯·冯·林蒂格, 威廉·S·布兰纳, 克日什托夫·帕尔琴夫斯基

附属公司

PMID： 18195010
预防性维修识别码：项目经理2441898
内政部： 10.1074/jbc。M708982200型

脊椎动物视网膜中维甲酸和非维甲酸化合物抑制视觉周期的代谢基础

马尔金·戈尔扎克等。生物化学杂志. 2008.

.2008年4月11日；283(15):9543-54.

doi:10.1074/jbc。M708982200。 Epub 2008年1月14日。

作者

附属

¹凯斯西储大学医学院药理学系，美国俄亥俄州克利夫兰市欧几里德大道10900号，邮编44106。

PMID： 18195010
预防性维修识别码：项目经理2441898
内政部： 10.1074/jbc。M708982200型

摘要

在脊椎动物视网膜光感受器中，视紫红质对光的吸收导致11-顺式到其全反式异构体的光异构化。为了维持视力，一个代谢系统进化而来，将所有的反式药物回收为11-顺式药物。编码视觉周期成分的基因突变可诱发一系列疾病，其特征是特定视黄醇周期中间产物水平异常，这一事实强调了这种视觉（维甲酸）周期的重要性。此外，强烈的光照会产生对视网膜有毒的维甲酸循环副产物。因此，抑制维甲酸循环在生理和病理状态下具有治疗潜力。已鉴定出四类抑制剂，包括维甲酸和非维甲酸化合物。我们使用纯化的视觉循环成分和体内系统研究了这些抑制剂的作用模式。我们报告称，在所测试的化合物中，视黄胺是视黄醇循环的最有效和最特异的抑制剂，它以视黄醇异构酶RPE65为靶点。疏水伯胺如法尼西胺也显示出抑制效力，但作用时间短，可能是由于快速代谢。这些化合物也是具有潜在高细胞毒性的反应性亲核试剂。我们还评估了一种特定的蛋白质介导机制在眼睛摄取维甲酸循环抑制剂中的作用。我们的结果表明，视黄胺通过视黄醇结合蛋白依赖性和视黄酸反应基因产物6非依赖性机制运输到眼睛并被眼睛吸收。最后，我们为卵磷脂的关键作用提供了证据：视黄醇酰基转移酶活性在介导基于视黄醇的视觉周期抑制剂的组织特异性吸收和持久治疗效果中发挥着关键作用。

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数字

**图1。**
**视觉周期抑制剂和类异戊二烯的结构。**基于它们的化学结构，被研究的化合物分为四类组：维甲酸衍生物(A类)，带正电荷的类视黄醇(B类)，含法尼基的类异戊二烯(C类)和非tinoid疏水伯胺，如法尼胺(D类).

**图2。**
抑制11-*可视化循环抑制器的顺式维生素E生产。*RPEmicrosomes为每种化合物在3μ浓度下测试5分钟米先前的通过添加10引发异构化反应μ米全部-反式-视黄醇和6μ米脱细胞视网膜醛结合蛋白。A类，进度异构化反应增加11-顺式-视黄醇集中精力。B类，抑制剂的剂量依赖性作用11-顺式-RPE微粒体产生视黄醇。分析在30°C持续1小时。C类，HPLC色谱图表明表达RPE65和LRAT的NIH3T3细胞中的异构化反应用10μ孵育米全部-反式-生长培养基中的视黄醇有机萃取前16小时。生长培养基的补充3μ米视网膜-NH₂或法尼西胺导致完全抑制11-顺式-视黄醇生产。峰值是根据相同的洗脱时间和吸收光谱进行鉴定采用合成标准(1, 11-顺式-视黄醇；2,13-顺式-视黄醇；三, 9-顺式-视黄醇；4,全部-反式-视黄醇）。D类显示数量11-顺式-用3μ米测试化合物的浓度（*，低于检测水平）。mAU、，毫吸光度单位。

**图3。**
**Ret-NH的结合₂至RPE65，通过淬火蛋白质荧光。**将纯化的RPE65稀释至20 m米Tris/HCl缓冲液，pH 7.6，含50 m米氯化钠和5%甘油（v/v）至最终浓度0.05μ米.增加数量Ret-NH的₂加入1μl等分DMF至2 ml总量样品。每次添加后，将滴定溶液混合并培养在285 nm激发和记录发射光谱前1分钟。A类，添加增加Ret-NH浓度₂(0–1 μ米).B类，最大排放量随增加而变化视网膜-NH₂在345nm处监测浓度；已更正为背景、稀释和内过滤效应；并用于估计显然的*K（K）_d日*显示的值。*美国。*，任意单位；F类，蛋白质荧光。

**图4。**
**11的比较-顺式-小鼠视网膜再生选定的视觉生色团抑制剂。**给适应黑暗环境的小鼠注射给药前4小时腹腔注射抑制剂的显示剂量150坎德拉米漂白20分钟^–2在甘兹菲尔德的房间里。再生11-顺式-之后，视网膜在黑暗中持续4小时用正相高效液相色谱法提取和分离眼类视网膜在“材料和方法”中进行了描述

**图5。**
**时间进程11-顺式-在给定视觉周期的情况下，再分析再生抑制剂。**A类,通过腹腔注射给小鼠每种受试化合物1mg，作为在“材料和方法”中描述。暴露于光后足以漂白80%的视紫红质，动物被放在黑暗中4–16 h。总量11-顺式-暗适应眼中的视网膜通过HPLC测定。暗适应状态下的视觉发色团水平(顶部)并漂白(底部)动物由*虚线酒吧。B类*，之间抑制作用持续时间的差异视网膜-NH₂和法尼西胺，剂量为0.1mg/小鼠。C类和D类表示强度增加的单闪光ERG响应未经治疗的对照小鼠和接受Ret-NH治疗的小鼠₂,13-顺式-维甲酸或TDH。小鼠暗适应5小时(C类)和16小时(D类)漂白后。增加闪光灯的串行响应刺激被绘制成a波和b波响应的函数与在暗适应条件下改变光强度。ERG衰减反应被Ret-NH保留₂-漂白16h后给小鼠进行治疗。光盘坎德拉。

**图6。**
**Ret-NH的影响₂关于A2E在*阿布卡4*^–/–小鼠及其抑制剂的比较WT和LRAT缺乏小鼠的清除率。** A类，代表性HPLCRet-NH中检测到的A2E色谱图₂-治疗小鼠，比较用一只只与载具一起处理的控制鼠标。一个月大*阿布卡4*^–/–给老鼠灌胃视网膜-NH₂（1 mg）于150μl植物油中，每2周服用2次在3个月大时最后一次灌胃后1周进行分析。老鼠被保持在完全黑暗中(D类)或12小时/12小时内暗/亮(*信用证*)循环（～10勒克斯）。A2E和iso-A2E水平为按照“材料和方法。”根据洗脱时间和紫外可见光谱确定峰光谱(*正确的*).峰值1，A2E；*峰值2*，iso-A2E。B类，眼睛中发现的A2E和iso-A2E定量。这个*错误酒吧*指出S.E(n个= 3; *,第页< 0.0001;视网膜-NH₂-处理过的与视网膜-NH₂-未经处理）。C类，Ret-NH的比较₂WT肝脏中随时间变化的水平和拉特^–/–单剂量灌胃小鼠（1mg）Ret-NH₂.多澳大利亚单位，毫吸光度单位。

**图7。**
**Ret-NH的相互作用₂RBP及其被细胞吸收表达LRAT和STRA6。** A类，通过萃取制备apo-RBP用乙醚进行holo-RBP。监测配体缺失的完整性通过紫外可见光谱法(*灰色线条*). apo-RBP与视网膜-NH₂并在快速蛋白质液相色谱上进行再验证离子交换柱生产Ret-NH₂-紫外可见光谱的RBP具有两个最大值，一个在280 nm处，另一个在330 nm处(*黑色线*)分别对应于蛋白质和视黄醇吸光度。在330 nm处进行吸收，以指示Ret-NH的结合₂到RBP。明显的*K（K）_d日*通过荧光确定值apo-RBP滴定（0.2μ米)随着浓度的增加视网膜-NH₂20米米Tris/HCl缓冲液，pH 7.6和50米米NaCl，如所示*B.C（英国）*，Ret-NH的摄取₂NIH3T3过度表达LRAT和STRA6与RBP结合。吸收效率为作为全部金额-反式-N个-提取的视黄酰胺来自单元格。色谱图表示正常相HPLC分离N个-从不同时间收集的细胞中提取的视黄酰胺与RBP-Ret-NH孵育后的点₂.峰值1、2，以及三对应所有-反式-N个-视黄酰胺类分别含有C18、C16和C14酰基。D类,视网膜-NH₂表达STRA6和LRAT的NIH3T3细胞的摄取(*填充形状*)或仅LRAT(*打开的形状*). 孵化含有Ret-NH的细胞₂绑定到RBP(圈子)位于浓度为8μ米无血清Dulbecco改良的Eagle’s培养基显示两种细胞株的吸收效率没有差异。当两种细胞系均为用“免费”Ret-NH培养₂在相同浓度下(*三角形*). 对照实验(插入)显示出稳健STRA6/LRAT细胞与与仅表达LRAT的细胞相比，holo-RBP。*澳大利亚*，吸光度单位。

**图8。**
**RBP在Ret-NH中的作用₂传递到眼睛。** 卢比^–/–WT小鼠灌胃剂量为1Ret-NH毫克₂或用胃灌胃法将芬利替尼注入油中。四个小时随后，将小鼠暴露在强光下，可以漂白90%的视紫红质然后将其置于黑暗中以允许视觉发色团再生。A类，小鼠眼睛中类维生素A的色谱图。*峰值1*,全部-反式-视黄酯；*峰值2*,2′-11-顺式-视网膜肟(*同步，反*).B类,11的量化-顺式-眼部样品中检测到的视网膜肟从交流，浓度N个-视黄醇酰胺和甲氰菊酯在RBP缺乏和WT小鼠的眼睛中发现。在中检测到化合物用30%正相高效液相色谱法从解剖的眼睛中制备己烷提取物乙酸乙酯/己烷用作溶剂，流速为1.4 ml/min。

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