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.2008年1月；27（1）：66-82。
doi:10.1111/j.1460-9568.2007.05986.x。

谷氨酸转运体GLT1b与突触PDZ结构域蛋白PICK1的相互作用

梅拉夫·巴桑 1, 刘红光, 肯尼思·马德森, 温克·阿姆森, 周嘉怡, 塔拉·德西尔瓦, 陈伟志, 艾莉森乐园, 迈克尔·A·布拉希, 杰夫·斯塔丁格, 乌里克·盖瑟, 尼娜·欧文, 保罗·A·罗森博格
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谷氨酸转运体GLT1b与突触PDZ结构域蛋白PICK1的相互作用

梅拉夫·巴桑等。 欧洲神经学杂志. 2008年1月.

摘要

突触可塑性是通过谷氨酸受体与PDZ结构域蛋白的相互作用实现的。谷氨酸转运体提供了兴奋性突触清除谷氨酸的唯一已知机制，而GLT1是主要的谷氨酸转运体。我们在这里表明，GLT1与PDZ域蛋白PICK1相互作用，PICK1在调节兴奋性突触谷氨酸受体的表达中起着关键作用。使用GLT1b的羧基尾部对神经元库进行酵母双杂交筛选，获得表达PICK1的克隆。在体外荧光偏振分析中，GLT1b C末端肽以高亲和力（K（i）=6.5+/-0.4 microM）与PICK1结合。我们还测试了基于GLT1和其他谷氨酸转运体变体的肽。GLT1b与来自大鼠脑裂解物的PICK1以及来自转染表达PICK1和GLT1b质粒的细胞的COS7细胞裂解物共同免疫沉淀。此外，GLT1b在COS7细胞中的表达改变了PICK1的分布，使其浮出水面。GLT1b和PICK1相互定位，并在培养的海马神经元中与突触标记物共定位。磷酸酯是蛋白激酶C（PKC）的激活剂，也是已知的PICK1相互作用物，对培养的大鼠前脑神经元的谷氨酸转运没有影响。然而，我们发现神经元暴露于一种肉豆蔻酸诱饵肽，其序列与GLT1b的C末端序列相同，该序列旨在阻断PICK1-GLT1b相互作用，从而使谷氨酸转运到神经元对佛波酯产生反应。这些结果表明PICK1-GLT1b相互作用通过PKC调节GLT1功能。

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数字

图1
图1
PICK1在酵母中与GLT1b相互作用。（A） 显示了谷氨酸转运体C末端序列中的PDZ域相互作用基序。除GLT1a外，所有已知的谷氨酸转运体在其C末端都有PDZ结构域相互作用基序，前提是在P0位置允许有任何疏水残基。（B） 在酵母双杂交筛选中，PICK1与GLT1b相互作用。将最初克隆的GLT1（GLT1a）的C端细胞质域和GLT1b C端的各种突变插入pDBLeu载体并与pPC86–PICK1共转化。目测评估生长和β-半乳糖苷酶的表达。最后四个氨基酸的缺失或额外酪氨酸残基的添加完全消除了GLT1b与PICK1的相互作用。GLT1a没有与PICK1相互作用。
图2
图2
GLT1b（GLT1b13）的13个氨基酸C末端在溶液中与PICK1相互作用，具有较高的亲和力和特异性。体外荧光偏振法分析肽与PICK1的相互作用。通过添加C端酪氨酸（GLT1b13+Y）或删除C端四个氨基酸（GLT1b13ΔETCI）抑制GLT1b–PICK1相互作用。与13个氨基酸肽（GLT1b13）相比，肽长度减少到10个氨基酸（GLT1b10）对相互作用没有显著影响。将C端羧基替换为酰胺基（GLT1b10-酰胺）阻止了相互作用，产生的结果与仅用载体（DMSO）获得的结果类似（见图5B）
图3
图3
丙氨酸诱变对GLT1b肽与PICK1相互作用的影响。P0位的丙氨酸取代（GLT1b13ETCA）对GLT1b肽与PICK1的亲和力影响不大。P1和P2（GLT1b13ETAI和GLT1b17EACI）位置的丙氨酸替代对相互作用产生了类似的中度抑制。
图4
图4
N-末端截断对GLT1b-肽与PICK1亲和力的影响。与截短肽GLT1b7（最后七个氨基酸）和GLT1b4（最后四个氨基酸）的相互作用大大减少。
图5
图5
其他谷氨酸转运体（所有11个单体）与PICK1的C末端肽相互作用的检测。（A） 除GLT1b外，只有EAAT5与PICK1表现出高亲和力相互作用。（B） 基于GLT1c变体的肽，与PICK1具有高亲和力，可与蛋白激酶C（PKC）α相媲美。基于EST数据库中发现的另一种变体形式的肽“EAAT2d”没有与PICK1相互作用。二甲基亚砜。
图6
图6
PICK1专门与GLT1b相互作用体内和在里面体外试验。（A） 抗PICK1抗体的特性。在鸡体内培养了一种针对PICK1的C末端16氨基酸肽的多克隆抗体（RGATGPTDKGGSWCDS）。亲和纯化抗体在大鼠神经元和大鼠脑蛋白的免疫印迹上识别出55kDa的单一条带。与抗原肽共培养阻断了免疫反应。（B） COS7细胞共免疫沉淀GLT1b和PICK1。将GLT1b的编码序列亚克隆到哺乳动物表达载体pcDNA3（Invitrogen）中，并在EGFP-C1载体（Clontech）中的EGFP的C末端融合PICK1编码区。用这两种质粒共转染COS7细胞。用C末端PICK1抗体而非鸡IgG（“对照”）进行免疫沉淀，可降低EGFP–PICK1融合蛋白。二级抗体也检测到约75kDa的鸡IgG带。GLT1b与PICK1共同免疫沉淀。代表兔抗鸡IgG的50-kDa带被用作中间抗体来降低鸡IgG，抗PICK1抗体也被二级抗体识别。（C） 从大鼠脑共免疫沉淀GLT1b、GLT1a和PICK1。用抗PICK1、抗nGLT1或抗cGLT1b抗体免疫沉淀大鼠前脑裂解物。PICK1蛋白与抗PICK1抗体和抗nGLT1抗体沉淀，沉淀量较小。用抗nGLT1抗体和抗PICK1抗体沉淀GLT1b。GLT1a蛋白也与多聚体中的抗cGLT1b和抗PICK1抗体免疫沉淀。免疫印迹检测到免疫复合物中的75kDa鸡IgG带和50kDa兔IgG条带。
图7
图7
COS7细胞表达GLT1和PICK1的免疫细胞化学定位。（A） GLT1b而非GLT1bΔETCI（GLT1b△4）诱导COS7细胞中PICK1的重新分布。GLT1b和GLT1bΔ4主要存在于质膜上，也存在于细胞质中。注意，GLT1b和GLT1bΔ4与EGFP在质膜上没有共同定位。相反，GLT1b与PICK1的共同表达导致PICK1融合蛋白重新分布到质膜（黄色标记）。EGFP–PICK1和GLT1b在质膜和核周分布处的共定域（黄色标记）都很明显。GLT1b最后四个氨基酸的缺失消除了共定位。（B） 与EGFP或EGFP–PICK1共同转染的GLT1a在COS7细胞中的分布。GLT1a免疫反应在质膜上和细胞内均有检测。与GLT1a共表达时，EGFP–PICK1分布没有改变（注意没有黄色标记）。仅EGFP广泛分布于细胞质和细胞核。EGFP–PICK1融合蛋白主要是细胞内的；约15%的细胞膜染色。当与GLT1bΔ4共表达时，检测到EGFP–PICK1融合蛋白标记细胞膜的程度相似。相反，当GLT1b与EGFP–PICK1共表达时，92%的细胞在细胞表面显示EGFP-PICK1，表现为黄色标记。双苯甲酰胺检测到的细胞核在合并后的图片中仅显示为蓝色。小方框表示右下角放大的区域。比例尺：20μm。
图8
图8
海马神经元PICK1、GLT1b和突触标记物的免疫细胞化学定位。（A–F）第14天海马培养在体外用在兔中培养的抗GLT1b（绿色）抗体和在鸡中培养的抗PICK1（红色）抗体标记，然后暴露于适当的二级抗体。（A–C）PICK1和GLT1b既存在于细胞体中，也存在于神经元过程中的点状分布中。覆盖两个图像（C）显示了两个蛋白质定位的部分重叠。（D–F）在高倍镜下，PICK1和GLT1b免疫反应在离散的大致球形单位中的定位很明显，提示存在突触。覆盖两个图像显示部分重叠（F）。（G-I）用小鼠单克隆抗突触素抗体（G）和抗cGLT1b（H）标记海马培养物。覆盖两个图像表明部分重叠（I），表明GLT1b与突触前标记物密切相关。（J–L）用抗NR1抗体（J）和抗cGLT1b（K）标记海马培养物。覆盖这两个图像表明部分重叠（L），表明GLT1b与突触后标记物密切相关。比例尺：20μm。
图9
图9
海马神经元中PICK1和GLT1b的功能相互作用。（A） 福尔波12-肉豆蔻酸13-醋酸酯（PMA；400 n米; 用C末端羧基肉豆蔻酰化肽（3μ米; 总时间3.5 h），但不包括C末端酰胺肉豆蔻酸肽。在存在活性GLT1b诱饵肽的情况下，PMA使谷氨酸摄取量降低至对照值的63.8±19.6%（未经PMA处理的GLT1b诱饵；对< 0.01). 显示了执行的12个实验的汇总结果。PMA中的实际摄取数据–对照：32 924±2506 cpm。（B） 比较了PMA和C末端羧基肉豆蔻酸肽对DHK敏感性和DHK不敏感性转运的影响。PMA仅在用C末端羧基肉豆蔻酸肽预处理的培养物中降低谷氨酸转运，而在DHK存在下没有。显示了执行的五个实验的汇总结果。PMA对照组的实际摄取数据：32 816±6423 cpm。（C） PMA和C末端羧基肉豆蔻酸肽降低了DHK敏感性转运成分。这些结果来自于B中显示的相同实验。DHK敏感成分减少了49.2±7.1%。DHK不敏感成分没有表现出对活性GLT1b诱饵肽的特异性作用。（D） 用C-羧基肉豆蔻酰化肽（'Pep'；3μ米)治疗（1.5小时）后服用PMA（400 n米添加或不添加肽，持续2小时）。PMA导致V降低64.8±4.2%最大值，对K无影响米。显示了两个实验中的一个实验的结果。**对< 0.01.
图10
图10
PKC激活与培养前脑神经元GLT1表面表达的变化无关。（A） 一个代表性的Western blot显示，佛波醇12-肉豆蔻酸13-乳酸盐（PMA）加或不加肉豆蔻酰化肽对GLT1a的细胞表面表达没有影响。在同一免疫印迹上观察肌动蛋白作为内部标准物，以比较“总”裂解物中的蛋白质负荷，并揭示“表面”裂解物的细胞质蛋白质标记。（B） 一个代表性的Western印迹显示400 n无影响米在GLT1b的细胞表面表达上具有或不具有活性诱饵肽的PMA。（C） 来自所进行的九个实验的合并数据的GLT1a带的密度测定。选择用于分析的条带为单体（约70kDa）和多聚体（约140kDa和210kDa。每组的结果相似，此处显示了汇总数据。未观察到显著差异。（D） GLT1b条带的密度测定汇集了九个实验的数据。选择用于分析的条带为单体（约70kDa）和多聚体（约210kDa的）。未观察到显著差异。（E） GLT1a表面与总免疫反应性的比率。对照组的比率约为31±2%。不同处理间无显著差异。（F） GLT1b表面与总免疫反应性的比率。对照组的比率为24±2%。不同处理间无显著差异。
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