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.2008年1月2日；28(1):264-78.
doi:10.1523/JNEUROSCI.4178-07.2008。

星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞的转录组数据库：了解大脑发育和功能的新资源

约翰·德·卡霍伊 1, 本·埃默里, 阿米特·考沙尔, Lynette C Foo（勒奈特·C·福）, 詹妮弗·L·扎马尼安, 凯伦·克里斯托弗森, 宜兴, 简·卢比舍, 保罗·A·克里格, 谢尔盖·克鲁彭科, 韦斯利·汤普森, 本·A·巴雷斯
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星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞的转录组数据库：了解大脑发育和功能的新资源

约翰·德·卡霍伊等。 神经科学. .

摘要

长期以来，由于缺乏明确区分神经细胞类型的方法，对控制中枢神经系统发育和功能的细胞间相互作用的理解受到了限制。在这里，我们描述了从发育和成熟小鼠前脑中前瞻性分离和纯化星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞的方法。我们使用FACS（荧光激活细胞分选）从S100beta启动子控制下表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的转基因小鼠中分离星形胶质细胞。然后，我们使用Affymetrix基因芯片阵列，通过对出生后第1天（P1）和第30天之间不同出生年龄的三种主要CNS神经细胞类型进行基因分析，创建了一个>20000个基因表达水平的转录组数据库。该数据库对急性分离的星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞表达的基因进行了详细的全局特征描述和比较。我们发现，Aldh1L1是星形胶质细胞的高度特异性抗原标记物，与传统星形胶质细胞标记物GFAP相比，其星形胶质细胞表达模式更广。星形胶质细胞富含特定的代谢和脂质合成途径，以及drapr/Megf10和Mertk/整合素α（v）beta5吞噬途径，表明星形胶质细胞是专业吞噬细胞。我们的发现对“胶质”细胞类别的概念提出了质疑，因为星形胶质细胞和少突胶质细胞的基因图谱与神经元的基因图谱一样不同。这一急性分离纯化星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞的转录组数据库通过提供改进的细胞类型特异性标记，为神经科学界提供了一种资源，并有助于更好地了解神经发育、功能和疾病。

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数字

图1。
图1。
星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞的纯化。A类、星形胶质细胞和神经元的纯化。使用OL谱系特异性抗体进行免疫筛选，使小鼠前脑的细胞悬浮液中的OPCs和OL耗尽。然后通过FACS纯化EGFP阳性星形胶质细胞，从剩余的细胞中分离出星形胶质细胞。分离出FACS纯化的EGFP阴性细胞，代表丰富的神经元群。B类，OLs的纯化。首先通过在BSL1凝集素平皿上平皿去除小鼠前脑的细胞悬浮液中的小胶质细胞，然后将剩余的细胞在PDGFRα平皿上孵育以纯化和去除OPCs，MOG平皿以纯化和去除髓鞘形成的OLs，以及GalC平皿以纯化剩余的OLs。C–E类、星形胶质细胞标志物的表达水平(C类)，OL(D类)、和神经元(电子)显示每种细胞类型的高纯度。这个年-轴表示由MAS 5.0确定的基因表达水平。误差线代表±SEM。
图2。
图2。
纯化CNS细胞类型的树状图和样本聚类。来自不同发育阶段的高纯度CNS细胞类型样本的层次聚类显示出三个不同的聚类，分别代表星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞。不同样本之间基因表达的相似性由树状图每个分支上的垂直距离表示。生物复制显示样本内的相关性最高，以短垂直距离表示。在每个细胞群体中，成熟和成熟样本（Astros P7、Astros P17、OLs、Myelin OLs）之间的基因表达比未成熟和成熟样品（Astro P1、Astro P7、OPCs、OLs）间的基因表达相关性更高。色条和样本标签描述了每种样本类型（绿色，星形胶质细胞；黄色，神经元；橙色-红色，OL谱系细胞；P，出生后的一天，用不同的色度表示；g，大脑皮层灰质星形胶质细胞，n，剩余内皮细胞耗尽的神经元样本）。
图3。
图3。
星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元特异性基因的表达。描述了星形胶质细胞（绿色条）、神经元（黄色条）和少突胶质细胞（红色条）表达的前40个细胞类型特异性基因。每个单独的基因表达水平都进行了标准化（参见材料和方法）并绘制在日志上2色阶，蓝色代表低表达，红色代表高表达。褶皱富集度可根据测井曲线进行估算2颜色条标度，例如，从中蓝色（−2）到红色（3）的变化表示表达水平的32倍差异。
图4。
图4。
基因表达数据验证就地杂交。A–C，冠状脑切片显示阵列数据鉴定为具有特异性神经元表达的基因的ISH：A类，11月；B类，Tmem130；C类，布鲁诺4。D–L，中轮廓区域对应的高倍图像A类显示海马、胼胝体（cc）和上覆皮层。D–F型，阵列数据确定的基因具有特定的神经元表达，在海马体和皮层中显示表达：D类，11月；电子，Tmem130；F类，布鲁诺4。G–I型，阵列数据确定的基因具有星形胶质细胞富集表达，显示白质和灰质中的纤维状阳性细胞：G公司，Ntsr2；H（H），Aldh1L1；我，Acsbg1。J–L型阵列数据确定的具有特定OL表达的基因的ISH，显示胼胝体中的白质表达和上覆皮层中偶尔的阳性细胞：J型，Fa2h；K（K），Tmem125/6330530A05Rik；L（左），Gpr62。所有ISH均在P17小鼠大脑上进行。比例尺：A–C，2毫米；D–L型，200微米。
图5。
图5。
Aldh1L1是一种特异性全细胞标记物。A–F，P15大鼠皮层的免疫组织化学染色显示Aldh1L1是一种细胞型特异性泛天冬氨酸细胞标记物。A–C大鼠皮层Aldh1L1（红色）和GFAP（绿色）染色。A类，Aldh1L1标记皮层中星形胶质细胞的胞体和广泛突起。B类GFAP标记星形胶质细胞中间丝细胞骨架，但不是Aldh1L1能够标记的精细过程。C类，GFAP标记一组星形胶质细胞：GFAP标记的细胞也呈Aldh1L1阳性（白色箭头），而Aldh1L2标记的许多星形胶质细胞未被GFAP标记（黑色箭头）。D–F型，Aldh1L1不标记神经元(D类，Tuj1），OL(电子、MBP+CC1）或OPC(F类，NG2）。G–I型、合并(我)Aldh1L1免疫染色(G公司)和强烈的BAC-Aldh1L1-EGFP荧光(H（H）)在Aldh1L1-EGFP转基因小鼠皮层中看到的结果显示，所有表达EGFP转基因的细胞也表达内源性Aldh1L1蛋白。比例尺：A–F，40微米；G–I型，60微米。
图6。
图6。
星形胶质细胞和少突胶质细胞发育过程中基因上调和下调。星形胶质细胞发育过程中最下调的前60个基因(A类，浅绿色条）和OL开发(B类和星形胶质细胞发育过程中最上调的前60个基因(C类，深绿色条）和OL开发(D类，红色条）。基因绘制在热图上，以说明不同发育阶段所有CNS细胞类型的基因表达模式。将每种细胞类型的单个基因表达水平标准化为年龄平均的星形胶质细胞表达(A类,C类)和年龄平均OL表达(B类,D类). 标准化值绘制在日志上2色阶，蓝色代表低表达，红色代表高表达。褶皱富集度可根据测井曲线进行估算2颜色条刻度。例如，从浅蓝色（-1）到中红色（2）的变化表示表达水平的八倍差异。注意，尽管在发育过程中很少有基因强烈下调(A类,B类)以细胞类型特异的模式表达，大多数基因在发育过程中强烈上调(C类,D类)以细胞类型特定的模式表达。
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