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.2008年1月；13(1):11-22.
doi:10.1016/j.ccr.2007.11.031。

决定增殖和细胞死亡之间平衡的E2F1依赖性基因表达程序

蒂莫西·霍尔斯特罗姆 1, 森喜朗, 约瑟夫·R·内文斯
附属公司

决定增殖和细胞死亡之间平衡的E2F1依赖性基因表达程序

蒂莫西·霍尔斯特罗姆等人。 癌细胞. 2008年1月.

摘要

Rb/E2F通路调节细胞增殖所必需的基因表达，但也会触发细胞凋亡。在正常增殖过程中，PI3K/Akt信号通路阻断E2F1诱导的细胞凋亡，从而起到平衡增殖和死亡的作用。我们现在确定了一组E2F1靶基因，这些靶基因被PI3K/Akt信号特异性抑制，从而区分E2F1的增殖或凋亡功能。RNAi介导的对一些PI3K抑制的E2F1靶基因的抑制，包括AMPKα2，会损害E2F1的凋亡诱导。AMP类似物激活AMPKα2进一步刺激E2F1诱导的细胞凋亡。我们还表明，E2F1凋亡表达程序在乳腺和卵巢肿瘤中的存在与良好的预后相一致，强调了E2F1增殖/凋亡程序平衡的重要性。

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数字

图1
图1。血清激活PI3K信号抑制E2F1靶基因的鉴定
答：我们以前的研究已经确定了PI3K信号在阻断E2F1诱导的凋亡中的作用，尽管这种抑制的机制尚不清楚。Ref52细胞感染了与对照组或表达E2F1的腺病毒相同的感染倍数（25 moi）。感染后，用标有“−”的低血清（0.25%）、标有“+”的高血清（10%）或含有PI3K抑制剂LY294002的高血清培养基处理细胞。E2F1诱导静止细胞凋亡，这种凋亡被血清激活的PI3K信号通路阻断。B.经血清剥夺、血清刺激或LY294002血清刺激处理的Ref52细胞感染了等重感染（moi），并在感染后24小时采集进行免疫印迹分析。E2F1蛋白的表达水平不受PI3K表达、血清治疗或PI3K抑制剂LY294002的影响。C.我们使用Affymetrix分析测试PI3K是否阻断潜在凋亡E2F1靶基因的表达。按照1A中所述处理细胞，并在感染后40小时收获细胞进行RNA提取。使用Affymetrix RAE230A阵列分析等量或RNA。Affymetrix基因表达数据使用robust-multiarray average（RMA）算法跨芯片进行标准化，并使用无监督的层次聚类进行分析。绿色阴影表示低基因表达，而红色阴影表示高表达。只有在静止期（基于Mas5数据）表现出E2F1最低2倍诱导的E2F靶标被纳入聚类。每个基因都是在低血清培养基中由E2F1诱导的（泳道1和4）。大多数E2F1靶点在高血清培养基中仍保持类似表达（第5道），但高血清中的E2F1不再诱导一个亚群（绿色条表示）。血清的这种抑制在很大程度上依赖于PI3K活性，因为当LY294002（第6车道）使PI3K功能丧失时，大多数这些基因的表达都会恢复。两类E2F1靶标均在右侧放大显示。
图2
图2。实时定量PCR检测PI3K抑制E2F1靶点的表达
A.AMPKα2（Prkaa2）、Nr4a3、Cyp26b1和p27的mRNA表达水平知识产权1用实时定量PCR检测经E2F1感染或未感染、高血清或PI3K抑制剂LY294002处理的细胞。感染后40小时分离RNA，与阵列实验中分离RNA的时间点相同。结果被归一化为GAPDH水平，并与感染对照腺病毒的无血清细胞中该基因的表达相关，并代表三个独立的实验。此处和2B中的误差条表示平均+/-标准偏差（SD）。B.AMPKα2、Nr4a3和p27的RT-PCR测量知识产权1在感染后24小时，在有或无PI3K共同感染的E2F1感染细胞中测定mRNA水平，并将其归一化为GAPDH水平。PI3K非感染细胞中每个基因的表达水平设置为100%，用于比较PI3K抑制基因表达的效果，从而强调PI3K的抑制，而不是E2F1的相对诱导。这些实验是使用低（0.25%）血清培养基进行的，是三个独立实验的代表。
图3
图3。选择性PI3K抑制靶点介导E2F1诱导的细胞凋亡
A.选定的PI3K抑制E2F1基因被靶向shRNA介导的U2OS细胞降解，以评估其在E2F1凋亡诱导中的作用。将对照和敲除细胞株去除血清，感染E2F1，并比较敲除细胞和对照细胞株的凋亡测定。结果显示为与对照细胞相比，在敲除细胞中观察到的凋亡百分比，表明至少有三个独立实验。显示多个彩色条带的基因被靶向不同位置mRNA的独立shRNA结构降解。误差线表示平均+/-标准偏差（SD）。B.相同的U2OS细胞系被剥夺血清48小时，感染E2F1并在感染后72小时拍照。E2F1感染后，载体控制细胞系几乎完全被凋亡杀死，而选择性PI3K抑制靶点的敲除会损害E2F1的凋亡杀伤，从而使细胞存活并在平板上聚集。比例尺，10μm。将野生型人成纤维细胞系C.IMR90细胞感染表达三种不同AMPKα2靶向shRNA结构的逆转录病毒。对这些株系进行AMPKα2敲除试验，去除血清，感染E2F1并在感染72小时后拍照。与U2OS细胞一样，IMR90细胞中AMPKα2的敲除也会削弱E2F1的凋亡诱导。比例尺，10μm。
图4
图4。AMPKα2协同表达或AMPK与AICAR协同激活E2F1-凋亡
A.IMR90细胞被表达AMPKα2、E2F1的腺病毒感染，感染水平低于阈值以诱导细胞凋亡，或AMPKβ2和E2F1的组合。AMPKα2和E2F1均未单独诱导IMR90细胞凋亡，但E2F1和AMPKβ2的联合作用显著增强了细胞凋亡。此处和4B中的误差条表示平均+/-标准偏差（SD）。去除U2OS细胞的血清，感染E2F1（0.5 MOI）的控制或亚凋亡阈值水平，并用AMPKα2的AMP类似激活物载体或AICAR治疗。AICAR在对照细胞中不促进细胞凋亡，但在感染E2F1的细胞中强烈增强细胞凋亡。shRNA敲除AMPKα2可显著削弱AICAR增强E2F1诱导的细胞凋亡。
图5
图5。E2F1靶基因在人类肿瘤中的表达分析
A.从乳腺癌表达研究（GSE1456）中提取PI3K抑制和非抑制E2F1靶基因的表达值。这些基因和肿瘤样本通过无监督的层次聚类进行组织。聚类基因的类别标识显示在右侧的红/绿栏中；PI3K未被抑制的E2F1靶标为绿色，而PI3K被抑制的E2F1靶标用红色表示（见5D）。乳腺肿瘤分为两大类，根据PI3K抑制和非抑制E2F1靶点的表达水平确定。上面用红色阴影聚类标记的第一类表达高水平的PI3K抑制基因和低水平的PI3G非抑制基因。第二类以绿色阴影聚类标记，显示出与其他乳腺肿瘤聚类相反的关系。这些肿瘤表达低水平的PI3K抑制E2F1靶点，通常表达高水平的非抑制靶点。PI3K基因表达特征用于预测PI3K通路的激活状态（蓝色表示低活性，红色表示高活性），并在聚集基因下方显示为色条。乳腺癌肿瘤分期显示在PI3K预测色条下方。根据PI3K抑制的E2F1靶基因的相对表达水平，将这两组乳腺癌患者指定为“低凋亡”和“高凋亡”，并根据右侧Kaplan-Meier生存曲线中的患者生存率绘制。数据表明，PI3K抑制（凋亡）靶基因相对水平较低的患者预后明显较差。B.对不同的乳腺癌数据集（GSE4922）进行了第5A节所述的类似分析。C.卵巢肿瘤（GSE3149），如乳腺癌肿瘤中所见，也被分为两大类，分别由PI3K抑制和非抑制E2F1靶点的高或低表达水平定义。PI3K基因表达特征用于预测PI3K通路的激活状态（蓝色表示低活性，红色表示高活性），并显示在聚集基因下方。卵巢肿瘤分期显示在PI3K预测值下方。根据PI3K抑制E2F1靶点的表达，将肿瘤分为两组，再次指定为“高凋亡”或“低凋亡”，并使用Kaplan-Meier曲线将患者分开，以获得生存结果。D.基因类别是指E2F1靶基因是否被PI3K信号抑制。PI3K评分是指基于二元回归权重映射原基因的相对PI3K通路状态的概率。肿瘤分期是指肿瘤诊断时的阶段。
图6
图6。PI3K/Akt通路对E2F1增殖和凋亡基因调控的控制
生长因子刺激激活了许多不同的细胞间信号通路，这些通路相互交叉，以控制诸如增殖和凋亡等细胞命运结果。例如，Cyclin D/Cdk4激酶复合物的激活导致视网膜母细胞瘤（Rb）磷酸化，将其从E2F1转录因子阻遏中释放出来。然后，E2F1自由地转录激活促进增殖和凋亡的基因。通过激活PI3K/Akt信号通路，细胞至少能够部分区分“正常”和致癌刺激生长，该信号通路可以通过E2F1抑制促凋亡靶基因的激活和凋亡。PI3K阻断凋亡的细胞能够在无凋亡干扰的情况下完成正常增殖。
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