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.2007年12月31日；179(7):1375-84.
doi:10.1083/jcb.200705160。

通过Cdc42 GTPase激活蛋白介导的抑制区实现细胞结构的邻近定位

宗天童 1, 向东高, 奥黛丽·豪厄尔, 英德拉尼·博斯, 丹尼尔·J·卢, 毕二飞
附属机构

通过Cdc42 GTPase激活蛋白介导的抑制区实现细胞结构的邻近定位

宗天童等。 J细胞生物学. .

摘要

出芽酵母酿酒酵母的细胞出生时携带定位的跨膜标志性蛋白，该蛋白指导随后极性轴的建立，从而在下一个细胞周期中极化生长以形成芽。在单倍体细胞中，相关的标志蛋白集中在前一次细胞分裂的位置，它们向该位置招募Cdc24，即保守极性调节器Cdc42的鸟嘌呤核苷酸交换因子。然而，新的极性轴不是在分裂位置极化，而是指向邻近但不重叠该位置。这里，我们表明Cdc42鸟苷三磷酸酶激活蛋白（GAP）Rga1在分裂位点建立了一个排斥区，阻止该位点内随后的极化。在缺乏局部Rga1 GAP活性的情况下，新芽实际上是在旧的分裂部位形成的。因此，Cdc42活化剂和GAP建立同心作用区，从而使极化定向发生在前一个细胞分裂位点附近但不在其内。

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数字

图1。
图1。
删除有机玻璃1导致两极分化并在上一个分区内萌芽。（A） 单倍体菌株YEF473A（野生型）、YEF2324非同步细胞群体中芽痕分布的定量(rga1Δ），YEF2392(rga2Δ立方米Δ）和YEF2380(rga1Δrga2Δ边界元3Δ). 每个菌株计数200个细胞，排除未添加的子细胞。生长芽基部只有几丁质环的细胞被认为有“0芽痕”rga1Δ细胞如A所示rga1当环之间的距离大到可以通过光学显微镜分辨时，偶尔可以看到Δ细胞（2）。（C） 芽痕的扫描电镜观察。使用A中描述的相同菌株进行扫描电镜观察。（D）使用隔膜环的位置作为活细胞中出芽模式的读数。单倍体菌株YZT82的细胞(CDC3-GFP公司，野生型），YZT55(rga1ΔCDC3-GFP公司)、和YZT111(rga2Δ立方米ΔCDC3-GFP公司)在YM-P培养基中生长到指数相，并在30°C下通过3D延时显微镜观察。时间以任意起点后的分钟和秒为单位。箭头表示在芽颈的母亲一侧有一个旧的隔膜环；箭头表示在新芽部位新生的隔膜环。从特定角度显示3D图像的视图：野生型细胞芽颈的斜侧视图rga1Δ细胞，以及rga2Δ立方米Δ电池。请注意，在胞质分裂和细胞分离后，野生型细胞在9分钟17秒到11分钟45秒之间，以及在5分钟29秒到7分钟31秒之间，母细胞与子细胞发生了明显的旋转rga2Δ立方米Δ电池。（E） 第一个萌芽rga1Δ子细胞在出生疤痕内形成。代表性野生型（YEF473A）和rga1Δ（YEF2324）单元格。细胞1和2分别代表出生疤痕内的偏心出芽和中心出芽。棒材，1μm。
图2。
图2。
Rga1在极性轴测定中的作用取决于其Cdc42-GAP活性。（A） GAP分析。Cdc42预结合到γ-[32P] GTP与GST、GST-Rga1 GAP结构域或包含R829A突变的同一结构域一起孵育，并绘制与Cdc42结合的放射性随孵育时间的变化曲线。插图显示，检测中使用了类似数量的野生型和突变GAP结构域。此GAP分析是三个实验的代表，结果一致。（B） 结合分析。重组myc标记的Rga1或Rga1829A兰特GAP结构域与珠结合重组GST-cdc42孵育Q61L问题（GTP绑定）或GST-cdc42T17N型（GDP-bound）评估约束力。（C） HA-Rga1和HA-Rga1829A兰特以类似的级别表示。蛋白质样品由YZT194制备(HA-RGA1型)和YZT195(HA-rga1型829A兰特). 星号表示酵母提取物中与HA抗体发生交叉反应的蛋白质。（D） HA-Rga1和HA-Rga1829A兰特在细胞周期中显示类似的定位模式。菌株YZT194和YZT195在23℃的YM-P培养基中生长到指数期，并使用抗HA抗体进行免疫荧光检测。（E） 菌株YZT194和YZT195芽痕的扫描电镜观察。（F） YZT198菌株活细胞中新隔膜环形成的可视化研究(HA-rga1型829A兰特CDC3-GFP公司)采用3D延时显微镜。观察到九个细胞中有八个在旧环内形成新的隔环。箭头表示旧隔环；箭头表示新的隔环。棒材，1μm。
图3。
图3。
删除有机玻璃1导致细胞分裂部位GTP-Cdc42水平升高。（A） YZT292（WT）、YZT293细胞(rga1Δ）和YZT294(rga2Δ立方米Δ）承载集成CDC3-GFP公司和GIC2-PBD-RFP用双色光学显微镜观察。从每个细胞的z截面堆栈中选择单个代表性GFP和RFP图像，以高分辨率显示Cdc3-GFP和Gic2-PBD-RFP的定位模式。棒材，1μm。（B） 用颈缩Gic2-PBD-RFP定量大乳细胞。YZT295电池(rga1Δrga2Δ立方米Δ）和A中的其他菌株被使用，并且只有具有透明隔膜的大乳细胞(n个=每种菌株50分）。
图4。
图4。
在胞质分裂期间和之后，异源蛋白将Rga1 GAP结构域靶向分裂位点，足以使Rga1在极性轴测定中发挥作用。（A） 胞质分裂期间与隔环相关的Rga1、Rga2和Cdc42定位的精细模式。YZT211活细胞(RGA1-GFP CDC3-Ds红色)，YZT166型(CDC3-樱桃)携带质粒pRS426-RGA2-GFP（RGA2的内源性水平很难检测，因此这里使用了携带RGA2-GFP的高拷贝质粒；RGA2定位模式没有随高拷贝质粒而改变，但GFP信号显著改善），YZT221(CDC42-GFP CDC3-Ds红色)在23°C下通过3D荧光显微镜观察到。A和B中的所有图像的方向都是使芽端朝上。（B） 胞质分裂期间Bud3-Rga1-GAP和Cyk3-Rga1-GAP融合的定位。YZT240电池(BUD3-rga1型700–1007年-GFP CDC3-樱桃)和YZT241(CYK3-rga1型700–1007aa-GFP CDC3-樱桃)如A.（C）细胞分裂后母细胞和子细胞的Cyk3-Rga1-GAP融合对出芽模式缺陷的差异抑制。（上图）JGY1645菌株的出生疤痕(rga1ΔCYK3-rga1号机组700–1007aa-GFP）。1和2分别代表出生疤痕内的偏心和中心萌芽；3表示抑制细胞中的轴向芽生。（底部）通过SEM观察到菌株JGY1645的出生疤痕（箭头）和芽疤痕。在含有2%甘油（YPG）的YP培养基中生长到指数期，并进行SEM处理。出生疤痕在YPG-贫瘠培养基比在富含YPD的培养基中显示得更好。只有3.3%CYK3-RGA1-GAP号母细胞(n个=273）菌株在YPG培养基中生长时，在芽痕内萌芽。（D） Rga1在极性轴测定中作用的模型。新轴和旧轴是指极化细胞生长的轴。M、 母亲；D、 女儿。棒材，1μm。
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工具书类

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