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.2008年1月；134(1):248-58.
doi:10.1053/j.gastro.2007.09.034。 Epub 2007年9月29日。

消除自然杀伤细胞/干扰素-γ的抗纤维化作用有助于酒精加速肝纤维化

Won-Il Jeong先生 1, 奥吉公园, Bin Gao公司
附属公司

消除自然杀伤细胞/干扰素-γ的抗纤维化作用有助于酒精加速肝纤维化

Won-Il Jeong先生等。 胃肠病学. 2008年1月.

摘要

背景和目标：慢性饮酒会加速病毒性肝炎患者的肝纤维化，这不能完全用乙醇增强的肝损伤来解释。在这里，我们确定了酒精加速肝纤维化的新机制：抑制自然杀伤（NK）细胞和干扰素-γ（IFN-gamma）的抗纤维化作用。

方法：给小鼠喂食含5%乙醇的液体饮食8周，即可实现酒精摄入。四氯化碳（CCl（4））诱导肝纤维化2周。肝星状细胞（HSC）也被分离和培养用于体外研究。

结果：与配对喂养的小鼠相比，CCl（4）治疗在乙醇喂养的小鼠中诱导了更大的HSC纤维化和更少的凋亡。聚肌苷-多肽基酸（Poly I:C）或干扰素-γ治疗抑制了双喂小鼠的肝纤维化，但在乙醇喂养小鼠中没有。与配对喂养的小鼠相比，乙醇喂养的小鼠NK细胞对HSC的细胞毒活性的Poly I:C激活减弱，这是由于乙醇喂养小鼠NK淋巴细胞上自然杀伤因子组2成员D（NKG2D）、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体和IFN-γ表达减少所致。在体外，与配对喂养的小鼠相比，来自乙醇喂养小鼠的HSC对IFN-γ诱导的细胞周期阻滞和凋亡具有抵抗力。这种抵抗是由于乙醇喂养小鼠HSC中信号转导子和转录激活子1（STAT1）的IFN-gamma活化减弱，这是由细胞因子信号蛋白抑制剂的诱导和氧化应激的产生引起的。最后，来自乙醇喂养小鼠的HSC对NK细胞杀伤有抵抗力，这可以通过转化生长因子-β1（TGF-β1）中和抗体来逆转。

结论：慢性酒精摄入可减弱肝脏中NK/IFN-gamma/STAT1的抗纤维化作用，这是治疗酒精性肝纤维化的新的不同治疗靶点。

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图1
图1
在CCl期间，喂食乙醇可减少HSC凋亡并加速肝纤维化4-诱导肝纤维化。给小鼠喂食乙醇饮食或对照饮食8周，然后注射CCl4在继续相同饮食的同时再坚持2周。第10周处死，收集血清以测定ALT(A类)收集肝脏进行免疫印迹(B类)或用于测量肝脏羟脯氨酸(C类)或免疫组织化学分析(D类). (D类)胶原纤维三色染色，α-活化HSC的SMA染色和凋亡的TUNEL染色。箭头表明α-座椅模块组件+隧道+细胞，按放大视野（×200）计数，并显示在面板上E类.面板中的值A类,C类、和E类为平均值±SEM（n=7）**P（P）< .01, ***P（P）<.001 vs成对喂食+0.25 mL/kg氯化石蜡4.
图2
图2
乙醇喂养可消除poly I:C的抗纤维化作用。注射CCl时，八周龄的乙醇喂养和配对喂养的小鼠保持相同的饮食4（0.1 mL/kg）加聚I:C或生理盐水额外2周。肝组织用抗-α-SMA抗体检测活化的HSC(A类)或进行免疫印迹(B类)或测定肝脏羟脯氨酸(C类). 面板中的值C类为平均值±SEM（n=6）*P（P）<0.05 vs相应盐水组。
图3
图3
乙醇喂养抑制肝NK细胞对HSC的杀伤，并下调NK细胞上NKG2D和TRAIL的表达。用poly I:C（5μg/g，腹腔注射）。16小时后，分离肝脏MNC或NK细胞，并用于对培养4天的HSC进行细胞毒性试验(A类). 肝脏跨国公司也接受RT-PCR分析(B类). 中的带密度面板B量化并显示在面板C.肝脏MNC也通过荧光激活细胞分选进行分析(D类). 中的值面板A,C类、和D类为平均值±SEM（n=6）*P（P）< .05, **P（P）<0.01 vs相应的配对喂养组。
图4
图4
乙醇喂养可消除干扰素的抗纤维化作用-γ八周龄的乙醇喂养和配对喂养小鼠保持相同的饮食，并注射CCl4（0.1 mL/kg）加干扰素-γ或生理盐水治疗2周。肝组织用抗α-SMA抗体染色以检测活化的HSC(A类)或进行免疫印迹(B类和C类)或测量肝脏羟脯氨酸(D类). 中的谱带密度面板B量化并显示在面板C中的值面板C和D类均为平均值±SEMs（n=4）*P（P）< .05, **P（P）<.01 vs相应的干扰素-γ未经处理的组。
图5
图5
来自乙醇喂养小鼠的HSC对IFN具有耐药性-γ刺激。(A类)从8周龄配对或乙醇喂养小鼠分离的HSC培养4天（D4 HSC）并用干扰素治疗-γ24小时。然后通过以下方法测量细胞增殖[三H] 胸腺嘧啶掺入试验。(B类)用干扰素刺激D4 HSC-γ（5 ng/mL）持续6或12小时。测定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3活性。(C–E类)用干扰素刺激D4 HSC-γ30分钟后，用抗pSTAT1抗体免疫染色检测STAT1激活(C类)或Western印迹法(D类). 中的带密度面板D量化并显示在面板E.英寸面板F从8周龄配对和乙醇喂养小鼠分离的HSC培养4或7天。然后通过Western blotting检测SOCS1蛋白。中的值面板A,B类、和E类是3到4个独立实验的平均值±SEM*P（P）< .05, **P（P）<0.01 vs相应的配对喂养组。
图6
图6
HSC与乙醇喂养小鼠肝细胞共培养抑制IFN-γ/HSC中的STAT1信号传导。(A类)D4 HSC与配对或乙醇喂养小鼠的肝细胞共培养24小时，然后用干扰素治疗-γ（5 ng/mL）30分钟，然后用抗pSTAT1抗体进行免疫染色。(B类)D4 HSC和肝细胞与抗氧化剂或不与抗氧化剂共培养24小时，然后用干扰素处理-γ（5ng/mL）30分钟，然后进行蛋白质印迹分析。带的密度被量化并显示在右侧面板值表示4个独立实验的平均值±SEM***P（P）<0.001 vs不含抗氧化剂的乙醇组。(C类和D类)D4 HSC在有或无0.5 mmol/L H的条件下培养2O（运行）2持续5分钟，然后用干扰素刺激-γ（5 ng/mL）30分钟，然后用抗pSTAT1抗体进行免疫染色(C类)IRF-1表达的RT-PCR分析(D类). (E类和F类)D4 HSC与配对或乙醇喂养小鼠的肝细胞共培养24小时，然后用TGF处理-β1（2.5 ng/mL，45分钟）或干扰素-γ+TGF公司-β1（用50 ng/mL干扰素预处理-γ首先45分钟，然后2.5 ng/mL TGF-β然后用抗pSmad3抗体进行免疫染色(E类)或COL1A2表达的RT-PCR分析(F类). 中的带密度面板F量化并显示在上面的面板。数值表示5个独立实验的平均值±SEM***P（P）<0.001与相应的IFN-γ（−）转化生长因子-β（+）组。(A类,C类、和E类,黑色箭头表现出积极的反应空白箭头反应很弱）。（对-Hep：对喂肝细胞；EtOH-Hep；乙醇喂肝细胞）。
图7
图7
来自乙醇喂养小鼠的HSC对TGF杀伤NK细胞具有抵抗力-β1–依赖机制。(A类)以配对或乙醇喂养小鼠的D4 HSC为靶细胞，以聚I:C处理的正常小鼠的肝脏MNC为效应细胞。测定肝脏MNCs对D4-HSCs的细胞毒性。数值为3个独立实验的平均值±SEM**P（P）<.01与相应的配对喂养组相比。(B类)将来自配对或乙醇喂养小鼠的HSC培养不同天，然后进行RT-PCR分析。(C类)配对或乙醇喂养小鼠的D4 HSC与小鼠重组TGF孵育-β1蛋白或TGF-β1个抗体20分钟，然后进行类似于面板A已执行。数值为6个独立实验的平均值±SEM*P（P）< .05; **P（P）<0.01 vs对应的0组。(D类)使用或不使用TGF培养经Poly I:C处理的跨国公司-β1个小时，然后表达NKG2D、TRAIL或IFN-γ通过RT-PCR分析测定。（P，双馈；Et，EtOH-fed）。
图8
图8
通过抑制HSC NK细胞杀伤和干扰素抑制慢性酒精加速肝纤维化模型-γHSC中的信号。(1)乙醇通过下调NKG2D（NK细胞激活受体）、TRAIL和IFN的表达，直接抑制NK对HSC的细胞毒性-γ. (2)乙醇刺激HSC产生TGF-β其次是抑制HSC的NK细胞杀伤；(三)乙醇诱导SOCS1蛋白表达，然后抑制IFN-γHSC中的信号；(4)乙醇刺激肝细胞产生氧化应激，随后抑制干扰素-γHSC中的信号。
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