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.2008年1月8日；105(1):13-9.
doi:10.1073/pnas.0710504105。 Epub 2007年12月18日。

EPLIN介导钙粘蛋白-连环蛋白复合物与F-actin的连接，并稳定环向肌动蛋白带

肯塔罗·阿伯 1, Masatoshi Takeichi先生
附属公司

EPLIN介导钙粘蛋白-连环蛋白复合物与F-肌动蛋白的连接并稳定周向肌动蛋白带

肯塔罗·阿伯等。 美国国家科学院程序. .

摘要

钙粘蛋白-钙粘蛋白复合物是许多动物物种细胞间粘附的主要机制。这种复合物通常与细胞质侧的肌动蛋白纤维结合，组织粘附连接（AJ）。在上皮细胞中，AJ围绕着靠近顶端表面的细胞，形成“粘连小带”或“粘连带”。然而，钙粘蛋白-肌动蛋白复合物和F-actin如何合作产生这些连接结构的机制尚不清楚。在这里，我们发现EPLIN（肿瘤中上皮蛋白丢失；也称为Lima-1），一种肌动蛋白结合蛋白，与α-肌动蛋白偶联，进而将钙粘蛋白-肌动素复合物与F-actin相连。如果没有EPLIN，这种联系就无法形成。当上皮细胞中的EPLIN被耗尽时，粘附带被破坏，并转化为拉链状连接，其中肌动蛋白纤维呈放射状排列。然而，非连接肌动蛋白纤维并没有受到EPLIN缺失的特别影响。众所周知，EPLIN具有抑制肌动蛋白解聚的能力，我们的结果表明EPLIN的功能是将钙粘蛋白-肌动蛋白复合物连接到F-actin，同时稳定肌动蛋白纤维的数量，从而形成粘附带。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
EPLIN与α-连环蛋白相互作用，偶联到钙粘附素-β-连环素复合物。(A类)将DLD-1细胞的裂解物与抗α-连环蛋白（α-cat）、E-cadherin（E-cad）或EPLIN抗体进行免疫沉淀（IP）。作为对照，使用免疫前血清（Pre）或小鼠或兔抗GFP IgG（IgG）。通过SDS/PAGE和Western blotting分析沉淀物以检测α-cat、E-cad或EPLIN。箭头表示α（下部)和β(上部)EPLIN亚型。在输入中，每个实验中加载2%用于免疫沉淀的裂解液。IB，免疫印迹。(B类)体外纯化蛋白之间的结合。已去除GST标签的重组EPLINα-标记蛋白(SI图7)如图所示，与各种GST融合蛋白涂层珠孵育。箭头指向下拉的EPLIN，用Flag标签抗体进行免疫印迹检测。EPLIN与GST-α-cat有效共沉淀，但不与GST、GST-β-cat（β-catenin）或GST-Ecadcyto共沉淀。然而，在同时存在α-连环蛋白和β-连环素（GST标签去除）的情况下，EPLIN可以被GST-Ecadcyto拉下。(C类)体外α-连环蛋白和EPLINα-Flag的纯化片段之间的结合，携带每种蛋白质的缺失。图表显示了EPLIN的删除序列(左侧)和α-连环蛋白(赖特)（另请参见SI图7). GST标记融合到每个分子的N末端。蛋白质的相互作用通过Western blotting与针对Flag标签（针对EPLIN）或α-catenin的抗体进行分析。所有具有VH3结构域结合的EPLIN的构建体。α（氨基酸1-643）与EPLIN的微弱相互作用可以检测到，但不可重复。
图2。
图2。
细胞-细胞连接处的EPLIN定位需要α-catenin。(A类)EPLIN、α-catenin和F-actin在DLD-1或MDCK细胞中的分布是三重染色的。显示了围绕细胞最顶端和最基底部分的共聚焦切片。这三种蛋白质在细胞的顶端水平上很好地共定位，但在基底水平上不共定位。特别是，在MDCK细胞的肌动蛋白应力纤维中无法检测到EPLIN。E-cadherin和α-catenin的分布基本相同；因此，只显示其中一个的数据。(B类)转染抗α-catenin siRNA的DLD-1细胞没有显示E-cadherin和EPLIN的共定位。Western blot分析证实α-catenin耗竭(SI图8). (C类)用图1所示的各种EPLIN结构稳定转染DLD-1细胞C类EPLINα、EPLINβ和EPLINdLIM显示细胞结合堆积，但EPLINdN和EPLINd C不显示。（比例尺：10μm）
图3。
图3。
EPLIN对于粘合带的形成是必不可少的。(A类)EPLIN缺失会破坏F-actin的顶端组织。转染对照siRNA或抗EPLIN siRNA的DLD-1细胞的F-actin、E-cadherin和EPLIN呈三重染色。图中显示了Apical-most和basil-most共焦截面。注意，通过EPLIN缺失，F-actin沿粘附带的圆形排列被转换为径向排列，这已被Western blot分析证实(SI图7). (B类)通过小鼠EPLIN表达拯救EPLIN缺失表型。用小鼠EPLINα-GFP cDNA转染DLD-1细胞；然后，用抗人EPLIN的siRNA处理表达和不表达小鼠EPLIN细胞的混合培养物。绿色，小鼠EPLIN；洋红，E-cadherin；蓝色，人类EPLIN。星号表示部分培养物不表达小鼠EPLIN。在这一部分中，E-钙粘蛋白的分布是无序的；然而，在小鼠EPLIN阳性区，E-钙粘蛋白仍在组织粘附带。箭头指向一个从siRNA处理中逃脱的细胞，导致小鼠和人类EPLIN的表达。这里使用的EPLIN抗体只识别人类EPLIN。（比例尺：10μm）
图4。
图4。
EPLIN稳定顶端肌动蛋白束并将其与钙粘蛋白-连环蛋白复合物连接。(A类)EPLIN缺失增强AJ处F-actin的latrunculin A敏感性。用对照或EPLIN siRNA处理的DLD-1细胞与1μM latrunculin A孵育30分钟，然后固定，并对F-肌动蛋白、α-连环蛋白和EPLIN进行三重染色。如箭头所示，F-actin在对照培养物中保持为簇状，与α-catenin和EPLIN共定位。当EPLIN耗尽时，F-actin和α-catenin分散。在EPLIN RNAi培养物中的一些细胞中，EPLIN表达没有下调，这些细胞维持肌动蛋白簇（箭头）。(B类)α-catenin缺乏细胞的顶端肌动蛋白束对EPLIN缺失敏感。用对照或EPLIN siRNA处理R2/7细胞，固定并对F-actin、ZO-1和EPLIN进行三重染色。控件中的箭头显示了ZO-1阳性F-actin束的示例，其中EPLIN也位于此处。如箭头所示，在EPLIN缺失的细胞中，ZO-1阳性结构折叠。(C–E类)体外肌动蛋白与各种蛋白质的结合。GST融合蛋白涂层珠与4μg聚合肌动蛋白（5-10μm长）孵育，并在3500×克沉淀物被广泛清洗，并进行Western blot分析以检测结合肌动蛋白（箭头）。在D类，GST-α-catenin涂层珠与纯化的EPLIN预孵育，洗涤，然后用于上述分析。在E类在用于F-actin下拉分析之前，GST-Ecadcyto-coaded珠与重组β-连环蛋白、α-连环素和EPLIN依次孵育。外周细胞可以与肌动蛋白相互作用，但只有当β-连环蛋白、α-连环素和EPLIN同时存在时。(F类和G公司)用F肌动蛋白孵育的珠子用Alexa Fluor-488结合的卵磷脂染色，然后用共焦荧光显微镜观察。在G公司图中显示了用β-连环蛋白、α-连环素和EPLIN孵育的GST-Ecadcyto珠表面的高倍视图，其上沉积有丝状肌动蛋白。（比例尺：A类,B类、和G公司，10微米；F类，50微米）
图5。
图5。
钙粘蛋白-EPLIN结合足以将连接肌动蛋白环与钙粘蛋白联系起来(A类)显示钙粘蛋白和α-连环蛋白之间融合结构的图表(上部)（13）或EPLIN(下部). 为了使用这些构建物产生转染体，将GFP标记融合到每个分子的C末端。(B类)EPLIN与钙粘蛋白-α-连环蛋白融合蛋白的结合。用钙粘附素或钙粘附素-α-连环蛋白融合蛋白稳定转染L细胞。用来自每个转染体裂解液的抗GFP标签抗体对这些分子进行免疫沉淀，并通过Western blotting对沉淀进行分析以检测EPLIN。(C类)稳定表达GFP标记钙粘蛋白的L细胞(上部)或钙粘蛋白融合蛋白(下部)在中指示A类对GFP标签和F-actin进行双重染色。（比例尺：10μm）
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