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.2007年12月12日；27(50):13781-92.
doi:10.1523/JNEUROSCI.2042-07.2007。

星形胶质细胞中的Cx43半通道和缝隙连接通道被激活的小胶质细胞释放的促炎细胞因子反向调节

Mauricio A零售 1, 尼古拉斯·弗罗格, 尼古拉斯·帕拉西奥斯·普拉多, 帕斯卡·埃赞, 巴勃罗·萨伊斯, 胡安·塞兹, 克里斯蒂安·久姆
附属公司

星形胶质细胞中的Cx43半通道和缝隙连接通道被激活的小胶质细胞释放的促炎细胞因子反向调节

Mauricio A零售等人。 神经科学. .

摘要

星形胶质细胞在维持正常神经元功能方面发挥作用，其中一些功能依赖于连接蛋白、间隙连接通道和半通道的蛋白质亚基。在炎症条件下，小胶质细胞释放细胞因子，包括白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子-α，通过缝隙连接减少细胞间通讯。现在，我们证明，无论是从活化的小胶质细胞中获得的条件培养液，还是这两种细胞因子的混合物，都可以通过Cx43半通道增强细胞与细胞外环境的交换。在Cx43敲除小鼠培养的星形胶质细胞中未检测到膜通透性的这些变化，这些变化被连接蛋白半通道阻滞剂（包括La3+、模拟肽和硝氟米酸）消除。缝隙连接通讯的减少和膜通透性的增加均由p38丝裂原活化蛋白激酶依赖性途径介导。然而，巯基还原剂二硫苏糖醇迅速逆转了膜通透性的增加，而不是缝隙连接抑制，表明最终的调节机制不同。用促炎细胞因子治疗降低了总Cx43和细胞表面Cx43水平，表明膜通透性的增加归因于半通道活性的增加。事实上，在小胶质细胞条件培养液处理的星形胶质细胞中，约220 pS的单一事件与Cx43半通道相对应，比在对照条件下更为频繁。最后，细胞因子的作用增强了葡萄糖的摄取并减少了葡萄糖的细胞间扩散，这可能解释了炎症条件下星形胶质细胞代谢状态的变化。因此，这种相反的调节可能会影响葡萄糖的运输，并肯定会改变参与脑炎症的星形胶质细胞的代谢状态。

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数字

图1。
图1。
在富集的星形胶质细胞培养物中添加LPS激活的MG可降低GJC并增加星形胶质细胞的膜通透性。一1–4，星形胶质细胞培养物和与MG共培养物中免疫荧光染色的代表性图片。GFAP阳性细胞（红色）对应于星形胶质细胞，而孤立的B4阳性细胞（绿色）对应于单独培养的星形胶质细胞中的MG（星形胶质细胞、，一1–2)在星形胶质细胞-MG共培养中（+小胶质细胞；一3–4)，均用LPS处理或未用LPS处理（10ng/ml；24小时）。比例尺，50μm。一5–12，SL/DT与LY的代表性图片(一5–8)和乙醚溴吸收(一9–12)分别测量GJC或半通道的功能状态。采用上述类似的培养模型和处理方法进行实验。比例尺，100μm。b条,c（c），对应于通过星形细胞缝隙连接的LY扩散量化的图形(b条)和乙醚溴吸收(c（c）)在富含星形胶质细胞培养物（星形胶质细胞）或星形胶质细胞-MG共培养物（+小胶质细胞）中。两种培养模型分别用LPS（10 ng/ml）处理（LPS）或不处理（C，对照）24小时。每个绘制的数字对应于三个独立实验的平均值±SEM**第页< 0.01, ***第页< 0.001; n.s.与对照组相比无显著差异；δδδ第页<0.001，与astrocyte-LPS组相比。
图2。
图2。
LPS-激活MG或TNF-α和IL-1β条件培养基诱导星形胶质细胞EthBr通透性增加，对Cx43半通道阻断肽敏感，在Cx43−/−星形胶质细胞中不存在。一，荧光场快照代表性图片，显示在应用CM*或Mix 24小时后，从Cx43野生型小鼠培养的星形胶质细胞中观察到EthBr染色的细胞核增加，但在Cx43−/−小鼠培养的星状胶质细胞中没有。比例尺，100μm。b条,c（c），图表表示使用CM治疗后EthBr阳性星形胶质细胞的数量*(b条)、TNF-α、IL-1β或混合物(c（c）)星形胶质细胞培养30分钟或24小时。在与EthBr孵育10分钟期间，在每个促炎治疗中，细胞在存在或不存在模拟肽gap26或gap27（300μg/ml）的情况下共培养(b条,c（c）). 每个绘制的值代表至少三个独立实验的平均值±SEM**第页<0.01和***第页<0.001，与未经治疗的星形胶质细胞组（C）相比。
图3。
图3。
用从LPS激活的MG或促炎细胞因子中提取的条件培养液处理星形胶质细胞，可通过Cx43半通道增加星形胶质细胞的膜通透性。一，每30秒记录一次星形胶质细胞中乙烯利摄取的代表性时间间隔。每个圆圈对应一次乙烯利摄入测定，用20个记录的细胞平均，在未经处理的条件下（对照；空圆圈）或与CM*（CM*；填充圆圈）或者Mix（Mix；灰色圆圈）孵育24小时后进行测量在星形胶质细胞培养中。对于每组，La3+(200 μ米)在EthBr摄取时间延迟测定的最后10分钟内应用。b条，量化未经处理条件下（对照；空白条）或用CM*（CM*；填充条）或Mix（混合；灰色条）处理的星形胶质细胞对乙烯利的摄取率。数据表示为在控制条件下测得的乙醚溴吸收率百分比。对于每组，在La存在（+）或不存在（-）的情况下测量染料摄取率3+(200 μ米)在时间流逝的最后。每个条形代表每组10个独立实验的平均值±SEM[作为参考的对照（−）组除外]**第页< 0.01, ***第页< 0.001; 无统计学意义，与指定组相比无显著差异。
图4。
图4。
抑制p38 MAP激酶或一氧化氮合酶可阻止混合诱导的膜通过Cx43半通道的通透性。一，Representative拍摄图像，显示接受24小时治疗的星形胶质细胞摄取乙烯利(一，混合）或存在1m米 我-名称，10μ米SB202190（SB），或10 m米DTT公司。在所有实验中，我-name和SB202190与Mix共涂24小时，而DTT在染料吸收试验前10分钟施用。比例尺，50μm。b条，显示抑制作用的图表我-Name、SB202190（SB）和DTT对星形胶质细胞混合染料摄取的研究。绘图数据（平均值±SEM，作为参考的混合物除外）表示为染料吸收抑制百分比，并从独立实验中获得***第页<0.001，与混合组相比。
图5。
图5。
Mix诱导的星形细胞GJC的抑制是通过抑制p38 MAPK而不是通过降低细胞内氧化还原状态来阻止的。一，代表性图片描述了未经处理条件下（对照组）或仅用Mix、Mix和10μ米SB202190（SB）或混合料和10 m米DTT（DTT）。比例尺，100μm。b条,c（c），提供在用Mix处理24小时的星形胶质细胞培养物中进行的SL/DT测定获得的荧光面积的定量的图(b条)或CM*(c（c）). 在每种情况下，星形胶质细胞与10μ米SB202190（SB）或10米米DTT并与未处理条件进行比较作为对照。以AU表示的每个值对应于从七个独立测量中获得的平均值±SEM。n.s.，无显著差异***第页< 0.001.
图6。
图6。
SB202190或DTT并不能阻止混合物引起的表面Cx43的减少。一，共聚焦代表性图片，描绘了未经处理的对照条件下星形胶质细胞培养物中用单克隆Cx43抗体制作的Cx43免疫标记(A类1)或用Mix处理24小时后(一2). 此外，星形胶质细胞也与Mix和SB202190共处理24小时(一三)或混合24小时和DTT，在最后10分钟内共同使用(一4). 比例尺，50μm。b条,c（c），总Cx43表达的代表性Western blot分析(b条)和细胞表面生物素化Cx43(c（c）)来自未经处理的对照条件下（泳道c）或用Mix暴露24小时后的星形胶质细胞培养物。SB202190与混合料共施24小时（车道SB），与混合料处理（车道DTT）最后10分钟内共施DTT相似。在b条，每条车道总共装载20μg蛋白质c（c），每个车道装载的生物素化蛋白总量。蛋白质斑点如所示b条和c（c）是针对不同时期开发的，因此，水平是不可比较的。在四个独立的实验中，对免疫荧光和Western blot分析进行了类似的观察。
图7。
图7。
从激活的小胶质细胞中获得的条件培养液诱导皮质星形胶质细胞中Cx43半通道的单一电流事件。一，施加了从−80到0 mV的电压斜坡，持续时间为3 s。斜坡是通过从0到−80 mV的转换启动的。b条,c（c），对照组和CM*处理的星形胶质细胞的电流分别为24小时。b条,d日，在控制条件下，未观察到半通道开口，乙醚溴吸收较低。c（c）,d日，在用CM*处理24小时的星形胶质细胞中，可以清楚地观察到半通道开口，与对照条件下的细胞相比，该细胞显示出接近两倍的EthBr摄取量。中的装箱区域d日在右下角显示为电导，其中两个约220 pS的半通道分别显示闭合到开放状态之间的转换。沿着两个闭合、一个断开和两个断开方向的倾斜轨迹表示斜坡应用期间电压的渐进变化。d日，在CM*处理的星形胶质细胞中，对La敏感的EthBr摄取分数3+(200 μ米)大于对照细胞，表明CM*处理的细胞中有更多的半通道开放。
图8。
图8。
促炎治疗增加星形胶质细胞的葡萄糖摄取。一用CM*处理融合的星形胶质细胞培养物24小时，然后在488 nm处测定荧光葡萄糖衍生物2-NBDG的摄取。一，显示按每个面板指示处理的星形胶质细胞细胞核染色的区域快照。比例尺，100μm。b条图中显示了在对照条件下（对照组）或用MG条件培养基（CM*）处理24小时后星形胶质细胞中以任意荧光单位表示的2-NBDG的摄取。在一些实验中，细胞被La处理3+(200 μ米)或gap27（300μg/ml）10分钟，然后进行染料摄取分析。每个标绘值代表四次独立测定的平均值±SEM。n.s.，无显著差异*第页<0.05和***第页< 0.001.
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