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.2008年3月30日；373(1):98-111.
doi:10.1016/j.virol.2007.11.012。 Epub 2008年2月20日。

单纯疱疹病毒受体连接蛋白-1在与糖蛋白D反式相互作用后下调

凯蒂·M·斯蒂尔斯 1, 理查德·S·B·米尔恩, 加里·科恩, 罗斯林·J·艾森伯格, 克劳德·克鲁梅纳切尔
附属公司

单纯疱疹病毒受体连接蛋白-1在与糖蛋白D交叉作用后下调

凯蒂·M·斯蒂尔斯等人。 病毒学. .

摘要

在单纯疱疹病毒（HSV）进入过程中，细胞表面或病毒内吞后发生膜融合。在这两种情况下，都需要糖蛋白D（gD）与连接蛋白-1或HVEM等受体结合。在本研究中，我们将表达gD的细胞与表达连接蛋白-1的细胞共同培养，以研究gD对细胞接触处连接蛋白-1（nectin-1）的影响。与gD表达细胞共培养过夜后，B78H1-C10、SY5Y、A431和HeLa细胞中的连接蛋白-1下调，HSV通过内吞进入这些细胞。相反，在HSV从质膜进入的Vero细胞上，连接蛋白-1没有下调。对B78H1衍生细胞的进一步分析表明，nectin-1下调与gD结合nectin1的能力相对应，是通过内化和低氢依赖性降解nectin-1。此外，gD对于表达连接蛋白-1的B78H1细胞的病毒内吞是必要的。这些数据表明，gD介导的连接蛋白-1内化的决定因素可能会在HSV进入时将其导向内吞途径。

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图1
图1
表达gD的细胞系。来自B78H1的克隆细胞系被设计成表达各种形式的HSV-1 gD（gDwt，gD（W294A）和gD（A3C-Y38C）。（A） 通过使用抗gD多克隆血清R7和与Alexa488偶联的抗兔Ig的FACS检测细胞表面上的gD表达。白色直方图表示R7缺失时的染色，并作为阴性对照。（B） CELISA检测细胞表面gD。用抗gD多克隆血清R8和抗兔次级抗体结合过氧化物酶和底物对细胞进行染色。减去未转染B78H1细胞检测到的吸光度作为背景。（C） CELISA将可溶性连接蛋白-1与表达gD的细胞结合。细胞在连接蛋白-1胞外区（HveC（346t））浓度增加的情况下培养。用抗连接蛋白-1多克隆兔血清R165和R154的混合物检测细胞结合连接蛋白-1。减去未转染B78H1细胞检测到的吸光度作为背景。
图2
图2
与gD表达细胞共培养后，B78H1-C10细胞上的Nectin-1表达。Nectin-1阳性B78H1-C10细胞与B78-gD（A3C-Y38C）细胞（左）、B78-g-Dwt（中）或B78-g D（W294A）细胞（右）以相等的比例混合。共培养16小时后，培养物固定、渗透并染色。用小鼠单克隆抗体CK41检测靶B78H1-C10细胞上的Nectin-1，然后用与Alexa488偶联的抗鼠Ig检测绿色（D，E，F）。用兔多克隆血清R7检测效应细胞上的gD，然后用抗兔免疫球蛋白结合Alexa594（G，H，I）检测。采用相位对比图像显示共培养的所有细胞（A、B、C），DAPI染色合并图像（J、K、L）中的所有细胞核（蓝色）。箭头指向不与效应细胞直接接触的靶细胞，因此保留了连接蛋白-1染色。给出了一个具有代表性的实验。（M） 直方图显示，与B78H1（黑线）靶细胞相比，与B78H1-C10（灰色）共培养16小时后，效应细胞上的gD表达不受影响。使用mAb MC5检测效应细胞上的gD（Qdot655阴性），然后使用与Alexa488偶联的抗鼠Ig。
图3
图3
细胞表面连接蛋白-1的下调。表达连接素-1的靶B78H1-C10细胞用Qtracker 655标记，并与表达指定形式gD的效应细胞或以1:2的靶效比与B78细胞（无gD）混合。过夜共培养后，细胞用CK41-PE染色，用FACS检测连接蛋白-1。根据Qtracker655荧光阳性选择靶细胞B78H1-C10，并在FACS图谱上显示，同时排除未标记的效应细胞。直方图表示Qtracker 655阳性靶细胞B78H1-C10的PE荧光。白色直方图表示与B78细胞共同培养的B78H1-C10细胞（无CK41-PE）的背景荧光。展示了一个具有代表性的实验。
图4
图4
检测B78H1衍生细胞中GFP-连接蛋白-1和连接蛋白-1的总量。（A） FACS分析GFP-连接蛋白-1的下调。表达GFP-nectin-1（B78H1-NGC12）的靶细胞用Qtracker655标记，并与表达指定gD形式的效应细胞或B78H1细胞（无gD）混合。共培养过夜后，通过FACS检测GFP荧光。直方图显示Qtracker655标记的靶细胞中的GFP荧光。几何平均荧光显示在右侧。为了进行比较，亲本B78H1细胞的背景荧光为3.9。（B） 用western blot检测细胞裂解物中的连接蛋白-1和GFP-连接蛋白-1的总量。将目标细胞（B78H1-C10或B78H1-NGC12）与指定的效应细胞混合。隔夜共培养后，在总细胞裂解液中检测到连接蛋白-1单克隆抗体CK8。在B78H1提取物中也观察到星号表示的主要非特异性条带（未显示）。连接蛋白-1（N1）和GFP-nectin-1（GFP-N1）的位置用箭头表示。分子量标记在左边以千道尔顿表示。（C） 细胞共培养上清液中的连接蛋白-1和GFP-连接蛋白-1的western blot检测。目标B78H1-C10细胞与效应细胞B78-gD（W294A）或B78H1（无gD）混合。过夜共培养后，收集细胞培养上清液并对细胞进行裂解。将5%的总细胞裂解液加载到第1和第2道中，将5%的上清液加载在第3、第4和第5道中，以比较单克隆抗体CK8检测到的连接蛋白-1的数量。全长连接蛋白-1（N1）的位置由箭头指示。通道6–9含有在新鲜培养基中稀释的可溶性连接蛋白-1（346t）的指示量，作为灵敏度控制。连接蛋白-1（346t）的位置由箭头指示。该印迹故意过度暴露（3.5分钟，Supersignal West Dura，Pierce），单克隆抗体CK8检测到的非特异性条带未标记。（D） 巴非霉素A（BFLA）的作用。表达GFP-nectin-1（GFP-N1）的NGC12靶细胞在与B78H1或B78-gD（W294A）效应细胞共培养前和共培养过程中，分别用BFLA预处理（+）或不处理（-）1 h和5 h。如B中那样进行细胞裂解和分析。
图5
图5
FACS分析比较了连接蛋白-1与gD作为连接蛋白-1配体的作用。目标B78H1-NGC12细胞（表达GFP-nectin-1）用Qtracker 655染色，并与表达nectin-1B78H1-C10效应细胞、表达gD（W294A）的B78H1细胞或未转染的B78H2细胞共同培养。在每个共培养的Qtracker 655阳性靶细胞B78H1-NGC12上检测到GFP-nectin-1。（A） 用抗GFP抗体Ab290和PE-偶联二级抗体检测表面表达。（B） 通过GFP荧光测定总表达。结果报告为与B78H1细胞（无gD）共培养后的荧光百分比，用作对照效应物。给出了一个具有代表性的实验。
图6
图6
非转染细胞系上受体的下调。用Qtracker655标记靶细胞，并与表达各种形式gD的效应细胞混合。经过过夜的共同培养，用适当的抗体对细胞进行染色：针对B78H1-C10、A431、SY5Y和Hela细胞的CK41-PE（抗连接蛋白-1）和CK6（抗连接素-1）其次是灵长类Vero细胞的抗鼠Ig加Alexa488。抗体CK6用于Vero细胞，因为CK41不识别非洲绿猴连接蛋白-1。CK6与CK41一样，检测人连接蛋白-1的下调（未显示）。每次共培养后，测量Qtracker 655阳性靶细胞的几何平均荧光。为了进行细胞系之间的比较，靶细胞上的荧光是指与对照B78H1（无gD）效应细胞共同培养后的荧光百分比。给出了一个具有代表性的实验。
图7
图7
进入B78H1-C10、B78、SY5Y和A431细胞期间的病毒防护。在4°C下附着在所示细胞表面后，HSV-1 KOS感染可在37°C下持续15分钟（A，C）或在4°C（B）下停留。然后冷却细胞并用蛋白酶K（B，C）或模拟消化（A）处理。在蛋白酶抑制剂存在下裂解后，通过免疫沉淀（mAb DL16）和蛋白印迹（pAb R69）检测全长gB。（A） 未经蛋白酶K消化而与细胞结合的gB总量。（B） 在没有入口的情况下，通过蛋白酶K控制表面gB的总消化。（C） 受保护的gB表明在蛋白酶处理之前，病毒在37°C下内化。PK表示蛋白酶K，右边的条表示114 kDa分子量标记的位置。
图8
图8
蛋白酶消化的病毒保护需要包膜gD。在4°C下，将不含包膜gC（非补体病毒标记N）或辅以wt-gD KOS（标记C）的KOSgDβ病毒附着在B78H1-C10细胞上。45分钟后，将温度切换至37°C，持续15分钟，或者如图所示，将细胞保持在4°C。在冰上冷冻细胞，在指示的位置用蛋白酶K消化细胞外蛋白（+PK）。在蛋白酶抑制剂存在下裂解后，通过mAb DL16免疫沉淀和蛋白质印迹（pAb R69）检测gB。右边的条表示114 kDa分子量标记的位置。
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