Impaired liver regeneration in Nrf2 knockout mice: role of ROS-mediated insulin/IGF-1 resistance

doi:10.1038/sj.emboj.7601950

.2008年1月9日；27(1):212-23.

doi:10.1038/sj.emboj.7601950。 Epub 2007年12月6日。

Nrf2基因敲除小鼠肝再生受损：ROS介导的胰岛素/IGF-1抵抗的作用

托拜厄斯·拜尔¹, 徐伟华, 丹尼尔·特普塞, 乌尔里希·奥夫·德姆·凯勒, 菲利普·布格农, 埃伯哈德·希尔特, 约阿希姆·蒂里, 简悦威, 萨宾·沃纳

附属公司

PMID： 18059474
PMCID公司： PMC2206132型
内政部： 10.1038/sj.emboj.7601950

Nrf2基因敲除小鼠肝再生受损：ROS介导的胰岛素/IGF-1抵抗的作用

托拜厄斯·拜尔等。欧洲工商管理硕士J. 2008.

.2008年1月9日；27(1):212-23.

doi:10.1038/sj.emboj.7601950。 Epub 2007年12月6日。

作者

托拜厄斯·拜尔¹, 徐伟华, 丹尼尔·特普塞, 乌尔里希·奥夫·德姆·凯勒, 菲利普·布格农, 埃伯哈德·希尔特, 约阿希姆·蒂里, 简悦威, 萨宾·沃纳

附属

¹瑞士苏黎世ETH苏黎世细胞生物学研究所生物系。

PMID： 18059474
PMCID公司： PMC2206132型
内政部： 10.1038/sj.emboj.7601950

摘要

肝脏经常受到手术诱导的代谢过载、病毒或毒素的挑战，这些都会诱导活性氧的形成。为了确定氧化应激对肝脏再生的影响并确定潜在的信号通路，我们研究了缺乏Nrf2转录因子的小鼠的肝脏修复。在这些动物中，肝细胞中几种细胞保护酶的表达降低，导致氧化应激。肝部分切除术后，肝再生明显延迟。通过体外和体内研究，我们确定氧化应激介导的胰岛素/胰岛素样生长因子抵抗是一种潜在机制。这种缺陷损害了肝切除术后p38丝裂原活化激酶、Akt激酶和下游靶点的激活，导致肝细胞死亡增加和增殖延迟。我们的结果揭示了Nrf2在生长因子信号调节和组织修复中的新作用。此外，他们对氧化应激诱导肝再生缺陷的机制提供了新的见解。这些发现可能为开发新的策略以改善急性或慢性肝损伤患者的再生提供基础。

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图1
Nrf2缺乏小鼠的肝脏再生受损。(A类)肝切除术后48小时，用苏木精/伊红染色Nrf2基因敲除小鼠（ko）和野生型（wt）同胞的肝脏切片。箭头表示肝细胞中的脂滴。(B类)增殖通过BrdU掺入进行评估。显示了损伤肝脏的代表性切片（肝切除术后48小时）。(C类)增殖细胞的百分比通过在×200倍放大镜下计数每个肝脏3-5个独立的显微镜视野来确定，n个（小鼠数量）>6只/基因型和时间点。(D类)冰冻切片染色以检测裂解半胱天冬酶-3。肝切除术后6小时染色细胞的百分比通过计数3-5个独立的显微镜视野（×，n个=每个基因型4个）。条形代表平均值±标准误差。；^**P（P）*<0.05;^***P（P）*<0.01.

图2
Nrf2敲除小鼠的正常和肝切除肝脏中Nrf2靶基因的mRNA水平降低和氧化应激增强。(A类)通过RPA分析编码Nrf2靶基因的转录物的总细胞RNA（每个时间点和基因型至少四只小鼠的混合肝脏中的10μg）。每个车道顶部标明肝切除或假手术后的时间；0h表示肝脏处于静止状态，在肝切除术中被切除；20μg tRNA作为阴性对照，1000 c.p.m.的杂交探针用作大小标记。与GAPDH核糖探针杂交作为负荷控制。显示了两个独立实验的代表性放射自显影图。(B类)在部分肝切除术后72小时，检测静息和受损肝脏的总裂解物的GST活性。用分光光度法测定谷胱甘肽/1-氯-2,4-二硝基苯共轭物的形成。条形代表平均值±标准误差。；^***P（P）*<0.01 (n个=6). (C类)分析肝细胞的GST活性。条形代表平均值±标准误差。；^**P（P）*<0.05;^***P（P）*<0.01 (n个=6). (D类)用DEH对未损伤和损伤肝脏（肝切除术后72小时）新鲜制备的冰冻切片（7μm）进行染色，并用荧光显微镜进行分析(n个⩾5). (电子)用H处理Nrf2基因敲除小鼠和野生型小鼠的原代肝细胞₂DCFH-DA和流式细胞术分析细胞内ROS水平。

图3
Nrf2基因敲除小鼠损伤肝脏中JNK和p38激活发生改变，但AP-1活性正常。(A类,B类)通过免疫印迹法分析Nrf2基因敲除小鼠和野生型小鼠（肝切除后每个时间点至少四只小鼠的混合肝脏和基因型）肝裂解液中的总蛋白（60μg），以了解磷酸化和总Erk、p38和JNK（A）以及磷酸化c-Jun（B）的水平。用GAPDH或Lamin A抗体染色膜作为负荷控制。显示了两个独立实验中的代表性斑点，以及不同肝切除实验中的裂解物。(C类)将含有AP-1结合位点的放射性标记寡核苷酸与来自正常和肝切除肝脏的总蛋白裂解物（20μg）孵育，并进行EMSA。添加过量的非标记寡核苷酸（标记的通道：冷组分）抑制迁移率转移，而添加带有突变AP-1结合位点的非标记的寡核苷酸则没有影响（标记的车道：多冷组分。）。

图4
Nrf2基因敲除小鼠受损肝脏中PI3K/Akt信号通路的激活减少。通过免疫印迹法分析Nrf2基因敲除小鼠和野生型小鼠（肝切除后每个时间点至少四只小鼠的混合肝脏和基因型）肝裂解液中的总蛋白（60μg），以检测PI3K p85α亚单位、磷酸化和总Akt、GSK-3β和S6激酶的水平(A类)，非磷酸化和磷酸化Bad，GAPDH和Lamin A(B类). 显示了两到四个实验中的代表性斑点，以及不同肝切除实验中的裂解物。

图5
Nrf2基因敲除小鼠受损肝脏中IGF-1R/IR信号减少。(A类)通过免疫印迹法分析Nrf2基因敲除小鼠和野生型小鼠肝切除后不同时间点的肝裂解物（60μg蛋白）的总IGF-1R和IR、磷酸化IGF-1R/IR、磷酸化和总Akt、磷酸化IRS-1/2（Tyr608）和总IRS-1以及GAPDH的水平。显示了用来自不同肝切除术实验的裂解物进行的两到三个实验的代表性印迹。(B类)使用IR抗体对Nrf2缺乏小鼠和野生型小鼠损伤肝脏（肝切除术后3 h）的总肝裂解物进行免疫沉淀。使用IR或pIR/IGF-1R抗体对沉淀进行免疫印迹分析。

图6
氧化应激损伤肝细胞中胰岛素诱导的Akt活化。用50或100 mU/ml GO预处理野生型小鼠的原代小鼠肝细胞2小时，然后用100 nM胰岛素刺激15分钟。通过30μg总蛋白与IGF-1R/IR和Akt的磷酸特异性抗体的免疫印迹来监测IGF-1R/IR信号的激活。用总Akt和GAPDH抗体染色膜作为对照。显示了三个实验中的代表性斑点。

图7
肝细胞中的Nrf2缺乏会导致胰岛素抵抗。(A类)对Nrf2基因敲除小鼠或野生型小鼠的原代肝细胞进行血清饥饿处理，并用100 nM胰岛素治疗指定时间。使用IGF-1R/IR和Akt的磷酸特异性抗体或总IR、Akt和GAPDH的抗体，通过western blotting分析蛋白裂解物（40μg）。显示了四个独立实验的代表性斑点。(B类)对Nrf2基因敲除小鼠或野生型小鼠的原代肝细胞进行血清饥饿处理，并用胰岛素治疗15分钟。用IR抗体对裂解液进行免疫沉淀，用IR或pIR/IGF-1R抗体对沉淀进行免疫印迹分析。(C类)或者，用IRS-1抗体对裂解产物进行免疫沉淀，并通过免疫印迹法监测IRS-1与PI3K-p85α的关联（上面板）。为了确保负载相等，通过蛋白质印迹分析30μg用于免疫沉淀的裂解物的总IRS-1、PI3K-p85α和GAPDH水平（下图）。显示了两个独立实验的代表性斑点。(D类)在肝切除术后3小时采集Nrf2基因敲除小鼠和野生型对照动物的肝脏样本。用IRS-1抗体免疫沉淀裂解液。通过蛋白质印迹分析沉淀中是否存在PI3K（p85α亚基）。沉淀物中IRS-1水平的分析作为对照。此外，在免疫沉淀前分析裂解液中IRS-1、PI3K（p85α亚单位）、p-Akt和GAPDH的水平（输入：下图所示的western blots）。显示了三个实验中的代表性斑点。

图8
Nrf2在受损肝脏中的作用示意图。Nrf2诱导ROS解毒酶的表达，从而阻止ROS的积累。其缺乏导致氧化应激，导致IRS-1和-2的酪氨酸磷酸化降低，很可能是通过ROS激活的JNK和其他可能的Ser/Thr IRS激酶。由于IRS-1的酪氨酸磷酸化是PI3K激活所必需的，因此Akt和下游靶点的磷酸化减少。

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