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.2008年4月；53(4):997-1012.
doi:10.1007/s10620-007-0133-6。 Epub 2007年12月4日。

口服鞘氨醇激酶抑制剂对小鼠溃疡性结肠炎的抑制作用

Lynn W Maines公司 1, 利奥·R·菲茨帕特里克, Kevin J法语, 闫庄, 夏祖平, 斯塔西·N·凯勒, 约翰·J·厄普森, 查尔斯·德·史密斯
附属公司

口服鞘氨醇激酶抑制剂对小鼠溃疡性结肠炎的抑制作用

Lynn W Maines公司等。 挖掘与疾病科学. 2008年4月.

摘要

炎性细胞因子作用机制中的一个关键步骤是刺激鞘磷脂代谢，包括激活鞘氨醇激酶（SK），该激酶产生促有丝分裂和促炎脂质1-磷酸鞘氨醇（S1P）。我们已经开发出口服生物可利用化合物，在体外完整细胞和体内癌症模型中有效抑制SK活性。在本研究中，我们评估了这些SK抑制剂对肿瘤坏死因子α（TNFalpha）细胞反应的影响，并评估了它们在小鼠溃疡性结肠炎葡聚糖硫酸钠（DSS）模型中的疗效。使用几种细胞系统，研究表明SK抑制剂阻断TNFalpha激活核因子κB（NFkappaB）、诱导粘附蛋白表达和促进前列腺素E（2）（PGE（2。在DSS诱导的溃疡性结肠炎急性模型中，SK抑制剂在减少疾病进展、结肠缩短和中性粒细胞渗入结肠方面等效于或比双戊烯更有效。SK抑制剂的作用与结肠中炎性细胞因子TNFalpha、白细胞介素（IL）-1β、干扰素γ（IFN）-γ、IL-6水平的降低以及S1P水平的降低有关。在慢性溃疡性结肠炎模型中，SK抑制剂也能降低疾病进展，在该模型中，小鼠接受为期3周的DSS周期，其间间隔一周的恢复期。在慢性模型中，SK的免疫组织化学显示，DSS处理的小鼠（与水处理的对照组相比）中SK的表达增加，而药物处理降低了表达。DSS组S1P水平也升高，药物治疗后显著降低。总之，这些数据表明SK是炎症的关键成分，这种酶的抑制剂可能有助于治疗炎症性肠病。

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数字

图1
图1。这些研究中使用的SK抑制剂的结构
图2
图2。ABC294640和ABC747080对细胞SK的抑制作用
在加入0.4μCi的[三H] 鞘氨醇。15分钟后，用氯仿：甲醇溶解细胞并提取[三H] 有机相中的鞘氨醇和[三H] 然后测定水相中的S1P。数值表示典型实验中三份样品的平均±sd SK活性。
图3
图3。ABC294640抑制TNFα诱导的NFκB活化
用指示浓度的ABC294640处理转染有与荧光素酶相关的TNFα应答启动子的成纤维细胞，然后用TNFα处理6小时。然后用发光法测量细胞表达的荧光素酶量。数值代表典型实验中三份样品的平均±sd荧光素酶活性，每个实验执行两次。
图4
图4。SK抑制剂抑制TNFα诱导的粘附分子表达
在DMSO（第2道）、25μM或6μM ABC747080（第3道和第4道）或25μM和6μM ABC 294640（第5道和第6道）存在的情况下，不处理人内皮细胞（第1道）或用TNFα（第2-6道）处理。然后用western blotting检测粘附分子的表达。对肌动蛋白进行了测量，显示所有车道的荷载相等（未显示数据）。
图5
图5。SK抑制剂对TNFα诱导的Cox-2活性的抑制作用
将大鼠IEC6细胞（A组）或人内皮细胞（B组）与二甲基亚砜（DMSO）作为溶剂对照（开条）或100 ng TNFα/mL在DMSO（实心条）或10μg/mL ABC294640（交叉阴影条）或ABC747080（方格条）存在下孵育18 h。通过ELISA测定分泌到培养基中的PGE2水平。数值代表典型实验中三份样品的平均值±sd，每个实验执行两次。
图6
图6。SK抑制剂和Dipentum对急性DSS结肠炎模型中DAI的影响
C57BL/6小鼠按以下方式治疗6天：正常饮水和每日口服PEG（开杆）、饮用水中2%DSS和每日口服聚乙二醇（实心杆）；饮用水中2%的DSS和每日口服PEG中50 mg/kg ABC294640（交叉条），饮用水中2%DSS和每天口服PEG（棋盘条）中50 mg/kgABC747080，饮用水中2%DSS和日常口服PEG中联苯乙酮50 mg/kg（虚线条）。在指定的日期，计算各组的疾病活动指数。数值代表每组5-6只小鼠的平均值±sd。
图7
图7。SK抑制剂和双戊烯对急性DSS-结肠炎模型结肠长度的影响
在第6天处死图6所述实验中的小鼠，从每只动物身上采集结肠并进行测量。数据表示平均±sd结肠长度。
图8
图8。急性DSS-结肠炎模型小鼠结肠的组织学
图6所示动物结肠薄片用H&E染色并检查病理变化。A组-水处理对照动物。B组-经DSS处理的动物。小组C——对ABC294640的中度反应。D组-ABC294640的完整应答器。
图9
图9。SK抑制剂和双戊烯对急性DSS-结肠炎模型结肠组织学评分的影响
在第6天处死图6所述实验中的小鼠，从每只动物身上采集结肠，并测定组织学评分。数值代表每组5-6只小鼠的平均值±sd。
图10
图10。SK抑制剂和双戊烯对急性DSS-结肠炎模型中性粒细胞浸润结肠的影响
如材料和方法部分所述，测量图6所示动物结肠的髓过氧化物酶活性。以单位/克组织为单位计算平均值±sd MPO活性。
图11
图11。SK抑制剂和双戊烯对急性DSS-结肠炎模型结肠细胞因子水平的影响
如材料和方法部分所述，从图6中描述的小鼠结肠样本中提取并测定指示细胞因子的水平。值表示每组4-5个样本中每个细胞因子的平均±sd量。
图12
图12。SK抑制剂对DSS-结肠炎模型动物结肠中S1P水平的影响
如材料和方法部分所述，提取图6所示小鼠的结肠样品，并通过LC/MS/MS分析S1P水平。值代表每组4-5个样本的平均值±sd。
图13
图13。SK抑制剂对慢性DSS-结肠炎模型DAI的影响
小鼠接受2个周期（每个周期7天）的DSS（1.5%周期1和1%周期2），2个周期的正常饮用水，并在第28天通过DAI随机分为8组小鼠。然后按如下方式处理小鼠：第1组（■）-正常饮用水，每天口服PEG400，持续7天（水对照）；第2组（▲）-含有1.5%DSS的饮用水，每日口服PEG，持续7天；第3组（▼）-含1.5%DSS的饮用水，每天口服ABC294640（50 mg/kg），连续7天；第4组（●）-含有1.5%DSS的饮用水，每天口服ABC747080（50 mg/kg），持续7天；第5组（◆）-含1.5%DSS的饮用水，口服双戊烯（50 mg/kg）*p<0.001。
图14
图14。35天慢性DSS模型小鼠SK表达的免疫组织化学研究
图A显示，在上皮细胞上进行光染色的水对照小鼠中SK的表达最低（垂直箭头）。B组显示一只只接受DSS治疗的小鼠，结肠隐窝（垂直箭头）和固有层细胞（水平箭头）有明显的染色增强迹象。C组显示一只DSS处理的小鼠在献祭前7天内接受50 mg/kg ABC292640。与DSS单独组相比，SK染色减少，整个组包括上皮细胞的轻度至中度染色（垂直箭头）。
图15
图15。SK抑制剂对慢性DSS-结肠炎模型动物结肠S1P水平的影响
如材料和方法部分所述，提取图13所示小鼠的结肠样品，并通过LC/MS/MS分析S1P水平。值代表每组8个样本的平均值±sd；*p<0.05。
图16
图16。SK抑制剂和双戊烯对慢性DSS-结肠炎模型结肠细胞因子水平的影响
提取图13所示小鼠的结肠样本，并按照材料和方法部分所述对所示细胞因子的水平进行分析。控制（透明条）、仅DSS（填充条）、DSS加ABC294640（交叉阴影条）、DS加ABC747080（棋盘格条）和DSS加Dipentum（虚线条）。值代表每组8个样品的平均±SD量。
图17
图17。SK抑制剂和双戊烯对慢性DSS-结肠炎模型血清细胞因子水平的影响
按照材料和方法部分所述，对图13中所述小鼠的血清进行所示细胞因子水平的分析。对照（透明条）、单独DSS（填充条）、DSS加ABC294640（交叉影线条）、DSS加ABC747080（方格条）和DSS加Dipentum（虚线条）。值代表每组8个样品的平均±SD量。
图18
图18。鞘脂代谢在IBD中作用的模型
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