跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2007年12月3日；179(5):1027-42.
doi:10.1083/jcb.200708174。

心肌蛋白相关转录因子通过鼻塞诱导和肌动蛋白重塑在上皮-间质转化中的双重作用

森田聪（Tsuyoshi Morita）1, 泰拉·马亚纳吉, Kenji Sobue公司
附属公司

心肌蛋白相关转录因子通过鼻塞诱导和肌动蛋白重塑在上皮-间质转化中的双重作用

森田聪（Tsuyoshi Morita）等。 J细胞生物学. .

摘要

上皮-间充质转化（EMT）是胚胎发育、纤维化和肿瘤进展过程中发生的关键过程。细胞间接触的分离和肌动蛋白细胞骨架的重塑是EMT的主要事件。在此，我们表明心肌相关转录因子（MRTFs；也称为MAL和MKL）是转化生长因子β（TGF-β）1诱导的EMT的关键介质。在这里检查的所有上皮细胞系中，TGF-β1触发MRTF的核移位。构成活性MRTF-A的异位表达可诱导EMT，而显性阴性MRTF-A或MRTF-A和-B的敲除可阻止TGF-β1诱导的EMT。MRTF与Smad3形成复合物。通过Smad3，MRTF-Smad3复合物与家族犬启动子区和人类蛞蝓基因中新发现的顺式元件GCCG样基序结合，激活蛞蝓转录，从而分离细胞-细胞接触。MRTFs还通过血清反应因子增加肌动蛋白细胞骨架蛋白的表达水平，从而触发肌动蛋白的细胞骨架重组。因此，MRTF是TGF-β1诱导的EMT的重要介导物。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
MRTFs参与TGF-β1诱导的EMT。（A） MDCK细胞在加入或不加入TGF-β1的情况下培养24小时。在使用Rho抑制剂TAT-C3的实验中，在刺激TGF-α1之前向培养基中添加50μg/ml TAT-C3。细胞被固定并用抗MRTF-A或-B抗体染色（绿色）。细胞核用Hoechst 33342（蓝色）染色。棒材，20μm。（B）用3xCArG-Luc转染MDCK细胞，转染或不转染pcDNA3.1–DN–MRTF-A或pcDNA3.1-C3。转染后18 h，用TGF-β1处理细胞，并测定荧光素酶活性。在使用Rho激酶抑制剂Y27632的实验中，将20μM Y27631与TGF-β1一起添加到培养基中。误差条表示三个独立实验的SD。（C）CA–MRTF-A细胞（克隆C2）、DN–MRTF-A细胞（克隆D2）和亲本MDCK细胞（WT）在有或没有TGF-β1的情况下培养24小时，然后用抗E-cadherin抗体（绿色）和Alexa 568偶联的鬼笔环肽（红色）染色。棒材，20μm。（D）不含TGF-β1的DME-FCS培养的MDCK和CA–MRTF-A细胞（克隆C2）的相控图像。棒材，50μm。（E）用抗MRTF-A（MRTF-AsiRNA1或2）和-B（MRTF-B siRNA1和2）的siRNAs转染MDCK细胞。用加扰siRNA作为对照。转染后，将细胞在有或无TGF-β1的情况下培养24 h，然后用抗E-钙粘蛋白抗体（绿色）和Alexa 568结合的卵磷脂（红色）染色。棒材，20μm。（F）DN–MRTF-A细胞（克隆D2、D10和D12）和亲代MDCK细胞在有或无TGF-β1的情况下培养（左）。在没有TGF-β1的情况下培养CA–MRTF-A（克隆C2、C3和C12）和亲代MDCK细胞（右）。通过免疫印迹法比较上皮和间充质标志蛋白的表达水平。（G）用MRTF-A和-B siRNA或对照siRNA转染MDCK细胞，然后用或不用TGF-β1培养。免疫印迹法比较MRTF-A和-B以及上皮和间充质标志蛋白的表达水平。
图2。
图2。
LMB处理条件下MRTF-A和-B的亚细胞定位。MDCK细胞在加入或不加入TGF-β1的情况下培养24小时，然后用LMB处理1小时。细胞被固定，并用抗MRTF-A和-B抗体（绿色）、Hoechst 33342（蓝色）和Alexa 568-结合性卵磷脂（红色）染色。棒材，20μm。
图3。
图3。
的表达式配置文件蛞蝓,蜗牛、和扭曲基因。（A） MDCK细胞与TGF-β1培养指定的小时数和EMT诱导基因的表达时间(段塞,蜗牛、和扭曲)采用RT-PCR进行分析。（B）MDCK或MDCK II细胞与TGF-β1培养指定天数段塞,蜗牛、和扭曲通过RT-PCR分析基因。（C）段塞,蜗牛、和扭曲通过RT-PCR比较CA–MRTF-A（克隆C2、C3和C12）及其亲本MDCK细胞中的基因。（D）DN–MRTF-A（克隆D2、D10和D12）及其亲本MDCK细胞在加入或不加入TGF-β1的情况下培养24 h段塞,蜗牛、和扭曲通过RT-PCR对基因进行比较。（E）用MRTF-A或-B siRNA或对照siRNA转染MDCK细胞，并用TGF-β1培养细胞24 h段塞,蜗牛、和扭曲通过RT-PCR对基因进行比较。
图4。
图4。
启动子分析家族鼻涕虫基因。（A） 荧光素酶报告子分析使用一系列5′启动子缺失突变体段塞基因（F1–F8）。第一外显子上游的～2.5-kb片段包含推测的CArG盒样序列、SBE和SP1-结合元件。用这些带有或不带有pcDNA3.1–CA–MRTF-A的报告构建物转染MDCK细胞，转染24 h后测量荧光素酶活性。误差条表示三个独立实验的SD。（B）启动子结构体F6的序列，它含有七个SP1结合元件和GCCG样基序。MRTF-A响应元素的核心区域下划线。（C）使用一系列突变的F6构建物进行荧光素酶报告子分析，其中SP1far、SP1near和/或GCCG-like基序中的位点如D所示发生突变。误差条代表三个独立实验的SD。（E）用MRTF-A和-B siRNA或对照siRNA转染MDCK细胞。转染后，将F1报告基因构建物导入细胞。用TGF-β1培养细胞24小时，然后测定荧光素酶活性。误差条表示三个独立实验的SD。（F）用指定的报告构建物转染MDCK细胞。然后用TGF-β1培养细胞24小时，并测定荧光素酶活性。误差条表示三个独立实验的SD。
图5。
图5。
9xcore区域的启动子分析–Luc结构。（A） 9xcore区域的示意图–Luc构造。（B）用MRTF-A或-B siRNA或对照siRNA转染MDCK细胞。转染后，将9xcore区域–Luc构建物导入细胞。用TGF-β1培养细胞24小时，然后测定荧光素酶活性。误差条表示三个独立实验的SD。（C和D）将9xcore区域–Luc构建物与pcDNA3.1-Smad1（3E）、pcDNA3.11-Smad2（2E）、pcDNA3.1S-mad3（3E，和/或pcDNA3.1–CA–MRTF-A一起导入MDCK（C）或HepG2（D）细胞，并在转染24 h后测量荧光素酶活性。误差条表示三个独立实验的SD。（E）HepG2细胞分别转染两种Smad3 siRNA（Smad3 siRNA1或2）或对照siRNA。转染后24小时，通过免疫印迹分析Smad3蛋白的表达水平。（F）用Smad3 siRNA或对照siRNA转染HepG2细胞。转染后，将9xcore区域–Luc构建物引入含有不同数量pcDNA3.1–CA–MRTF-A（0μg[−]、0.3μg[+]、0.6μg[++]和0.9μg++]）的细胞中，并测定荧光素酶活性。误差条表示三个独立实验的SD。
图6。
图6。
MRTF-A或-B与Smad3之间的相互作用。（A） MDCK细胞中表达的MRTFs和Smad3的免疫共沉淀。MDCK细胞在有或无TGF-β1的情况下培养24 h。使用非免疫兔IgG（对照IgG）、抗Smad3或抗MRTF-A或-B抗体进行协同免疫沉淀。沉淀剂中的蛋白质用所示抗体通过免疫印迹法检测。（B）Smad3截短突变体的示意图。显示了MH1域、链接器区域和MH2域。所示数字表示氨基酸位置。（C）体外合成了HA-Smad3 full、HA-Smad NL、HA-Smad C和全长FLAG–MRTF-A蛋白，并使用抗HA抗体通过共免疫沉淀分析了它们之间的相互作用。（D）MRTF-A和-B蛋白截短序列的示意图。显示了RPEL基序、基本域（B）、富Q域（Q）、SAP域、线圈域和事务激活域（TAD）。（E）体外合成了FLAG–MRTF-A蛋白和HA-Smad3C蛋白的截短序列，并使用抗FLAG抗体通过共免疫沉淀分析了它们之间的相互作用。（F）体外合成了FLAG–MRTF-A全蛋白、-B全蛋白，-AΔB和-BΔB以及HA-Smad3全蛋白，并使用抗HA抗体通过共免疫沉淀分析了它们之间的相互作用。
图7。
图7。
MRTF/Smad3与核心区域序列的结合家族鼻涕虫发起人。（A） 使用生物素化核心区DNA探针和体外进行DNA-蛋白质结合分析–合成HA-Smad3 full和FLAG–MRTF-Afull。与DNA探针结合的蛋白质用所示抗体通过免疫印迹法进行检测。（B）MRTF-A对Smad3与含有核心区域的DNA探针结合的协同效应呈剂量依赖性。（C）对MRTF-A和-B以及Smad1、2和3与内源性核心区序列结合的ChIP分析段塞基因。MDCK细胞在有或没有TGF-β1的情况下培养24小时，使用非免疫兔IgG（对照IgG）、抗-MRTF-A和-B以及抗Smad1、2和3抗体进行ChIP测定。进行PCR以确定段塞围绕核心区域的启动子序列。
图8。
图8。
MRTFs调节TGF-β1诱导的MDCK细胞肌动蛋白重塑。（A） MDCK细胞在加入或不加入TGF-β1和/或环己酰亚胺（CHX）的情况下培养24小时。然后固定细胞，并用Alexa 568共轭指骨肽染色。棒材，20μm。（B）MDCK细胞在加入或不加入TGF-β1的情况下培养24小时。通过免疫印迹法比较所示细胞骨架蛋白的表达水平。（C）DN–MRTF-A（克隆D2、D10和D12）和亲代MDCK细胞在有或无TGF-β1的情况下培养（左）。在没有TGF-β1的情况下培养CA–MRTF-A（克隆C2、C3和C12）和亲代MDCK细胞（右）。通过免疫印迹法比较肌动蛋白细胞骨架蛋白的表达水平。（D）用MRTF-A或-B siRNA或对照siRNA转染MDCK细胞，并用或不用TGF-β1培养。免疫印迹法比较MRTF-A、-B和细胞骨架蛋白的表达水平。（E和F）荧光素酶报告子分析使用启动子结构进行卡尔德蒙,原肌球蛋白1, α-座椅模块组件、和β-肌动蛋白包含原生（WT CArG）或突变（mut CArGhttp://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200708174/DC1).用这些细胞骨架启动子构建物转染MDCK细胞。转染后18h，分别用TGF-β1和TGF-α1培养24h，测定荧光素酶活性。对于F，pcDNA3.1–DN–MRTF-A载体与细胞骨架启动子结构一起转染。误差条表示三个独立实验的SD。
图9。
图9。
MRTF-A和-B在小鼠NMuMG细胞和人HK-2细胞中诱导EMT。（A） 将NMuMG CA–MRTF-A（克隆C4和C9）、DN–MRTF-A（克隆D34和D41）和亲代NMuMG-β1培养24 h，并用Alexa 568结合性阴茎肽染色。棒材，20μm。（B）HK-2 CA–MRTF-A（克隆C1和C3）、DN–MRTF-A（克隆D1和D3）和亲代HK-2细胞在有或无TGF-β1的情况下培养48 h，并用Alexa 568结合的卵磷脂染色。棒材，20μm。（C）未经TGF-β1培养的NMuMG CA–MRTF-A（克隆C4和C9）和HK-2 CA–MRTCF-A（克隆C1和C3）细胞的相对照图像。棒材，50μm。（D和E）NMuMG（WT）、NMuMG-CA-MRTF-A（克隆C4和C9）、HK-2（WT，和HK-2 CA-MRTF-A（克隆C1和C3）细胞在没有TGF-β1的情况下培养（左）。使用或不使用TGF-β1培养NMuMG（WT）、NMuMG-DN–MRTF-A（克隆D34和D42）、HK-2（WT。通过免疫印迹法比较所示蛋白的表达水平。（F）NMuMG细胞与TGF-β1培养指定天数段塞,蜗牛、和扭曲通过RT-PCR分析基因。（G）培养不含TGF-β1的NMuMG和NMuMG-CA-MRTF-A（克隆C4和C9）细胞（左）。NMuMG和NMuMG-DN-MRTF-A（克隆D34和D42）细胞在有或无TGF-β1的情况下培养24 h（右）。的表达式级别段塞,蜗牛、和扭曲通过RT-PCR分析基因。（H）HK-2细胞与TGF-β1培养指定的天数，表达时间进程段塞,蜗牛、和扭曲通过RT-PCR分析基因。（I）在无TGF-β1的情况下培养HK-2和HK-2 CA–MRTF-A（克隆C1和C3）细胞（左）。HK-2和DN–MRTF-A（克隆D1和D3）细胞在有或无TGF-β1的情况下培养24小时（右）。的表达式级别段塞,蜗牛、和扭曲通过RT-PCR分析基因。
图10。
图10。
MRTF/Smad3也调节人类段塞启动子活性。（A） 人体示意图段塞启动子结构及其位点突变序列。在第一外显子上游的～1.1-kb片段中，存在潜在的SBE元件、CArG盒样序列和GCCG样基序。（B）类GCCG基序的序列比对家族鼻涕虫和人类段塞启动子区域。所示数字表示核酸从起始密码子的上游位置。（C）用位点突变报告体转染HepG2细胞。X轴数字表示A中报告结构的数量。细胞在有或无TGF-β1的情况下培养24小时，然后测量荧光素酶活性。误差条表示三个独立实验的SD。（D）HepG2细胞与pcDNA3.1–CA–MRTF-A和/或pcDNA3.1-Smad3（3E）一起转染位点突变的报告基因结构。X轴数字表示A中报告结构的数量。转染24小时后测量荧光素酶活性。误差条表示三个独立实验的SD。（E）使用含有人类段塞GCCG样基序和体外–合成的FLAG–MRTF-A和HA-Smad3。（F）HK-2细胞在有或无TGF-β1的情况下培养24 h，并使用非免疫兔IgG（对照IgG）、抗Smad1、2和3以及抗MRTF-A和-B抗体进行ChIP检测。PCR检测人类段塞围绕GCCG样基序的启动子序列。（G）使用含有人类段塞SBE和体外–合成的FLAG–MRTF-A和HA-Smad3。（H）与人类DNA探针结合的HA-Smad3蛋白量段塞通过DNA-蛋白结合分析比较GCCG样基序或SBE。（I）人类内源性SBE基序结合的MRTF-A和-B以及Smad1、2和3的ChIP分析段塞基因。PCR检测人类段塞SBE周围的启动子序列。（J）MRTFs在TGF-β1诱导的EMT中的双重功能方案。TGF-β1刺激可诱导Smad3的磷酸化，从而导致其核移位。TGF-β1也激活Rho，导致MRTF移位到细胞核。MRTF–Smad3复合物与GCCG样基序结合段塞基因和增强段塞转录，导致细胞在缺乏细胞-细胞接触的情况下变得分散。此外，MRTF–SRF复合物通过启动子区的CArG盒增强各种肌动蛋白细胞骨架基因的转录，导致肌动蛋白重塑。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

工具书类

    1. Batlle，E.、E.Sancho、C.Franci、D.Dominguez、M.Monfar、J.Baulida和D.H.Garcia。2000转录因子snail是上皮性肿瘤细胞中E-cadherin基因表达的阻遏物。自然细胞生物学。 2:84–89.-公共医学
    1. 博米克，N.A.，M.Ghiassi，A.Bakin，M.Aakre，C.A.Lundquist，M.E.Engel，C.L.Arteaga和H.J.Moses。2001转化生长因子-beta1通过RhoA依赖机制介导上皮向间充质的转分化。分子生物学。单元格。 12:27–36.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. 博米克，N.A.，M.Ghiassi，M.Aakre，K.Brown，V.Singh和H.L.Moses。 2003.TGF-β诱导的RhoA和p160ROCK活化参与了Cdc25A的抑制并导致细胞周期阻滞。程序。国家。阿卡德。科学。美国100:15548–15553。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. 布兰克、R.S.、T.C.麦克奎恩、K.C.尹、M.M.汤普森、K.竹叶、R.J.施瓦茨和G.K.欧文斯。1992顺式结构中平滑肌α-肌动蛋白启动子的元件，用于平滑肌转录激活。细胞类型特异性调节的证据。生物学杂志。化学。 267:984–989.-公共医学
    1. Bolos，V.、H.Peinado、M.A.Perez-Moreno、M.F.Fraga、M.Esteller和A.Cano。2003转录因子Slug抑制E-cadherin表达并诱导上皮细胞向间充质细胞转化：与蜗牛和E47阻遏物的比较。细胞科学杂志。 116:499–511.-公共医学

出版物类型

MeSH术语