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.2008年2月；28(3):1041-6.
doi:10.1128/MCB.01504-07。 Epub 2007年11月26日。

果蝇UTX是一种组蛋白H3-Lys27去甲基酶，与RNA聚合酶II的延伸形式共定位

埃德温·史密斯 1, 李敏圭, 本杰明·温特, 内森·M·德罗兹, 乔尔·艾森伯格, 拉明·希哈塔, 阿里·希拉蒂法德
附属公司

果蝇UTX是一种组蛋白H3 Lys27脱甲基酶，与RNA聚合酶II的伸长形式共定位

埃德温·史密斯等。 分子细胞生物学. 2008年2月.

摘要

组蛋白H3在Lys27的甲基化（H3K27甲基化）是沉默染色质的标志，而H3K4甲基化与活性染色质区域相关。在这里，我们报告了果蝇JmjC家族成员dUTX，特别是去甲基化的二和三甲基化但不是单甲基化的H3K27。染色质上的dUTX定位与RNA聚合酶II（Pol II）的伸长形式相关，并且dUTX可以与Pol II相关。此外，热休克诱导导致dUTX向hsp70基因募集，就像其他几种Pol II延伸因子一样。我们的数据表明，dUTX与主动转录的基因密切相关，并可能为转录平衡基因上预启动的Pol II的激活如何需要H3K27去甲基化提供一个范例。

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图1。
图1。
这个果蝇属UTX的同源物是一种H3赖氨酸27脱甲基酶。（A） 的域组织示意图果蝇属UTX（CG5640）及其人类同源物。UTX家族成员在C端有一个保守的JmjC结构域，在N端有5到6个四肽重复序列（TPR）。人类UTX和UTY分别是来自性染色体假常染色体部分的X和Y染色体连锁同源物，因此高度相似。由于这种X-Y对的Y连锁拷贝通常以较高的速率发生突变（13），因此可以认为X连锁拷贝UTX与果蝇属同源。与UTY或JMJD3相比，dUTX与UTX的总体序列一致性更高。（B） 重组dUTX在杆状病毒系统中的表达。从SF21细胞中纯化N-末端标记的dUTX。星号表示非特异性多肽。（C） 在以散装组蛋白为底物的组蛋白去甲基化试验中使用不同数量的重组dUTX（1和2μg），并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析反应混合物，然后用组蛋白甲基化不同位点的抗体进行Western印迹。1m，单甲基化；2m，二甲基化；3m，三甲基化。（D） 在JmjC结构域的预测铁结合位点中表达具有双重突变（H883A和E885A）的突变型dUTX（dUTXm）。按照面板B所述纯化重组dUTXm。（E）H3K27脱甲基酶活性与dUTX或dUTXm各2μg的比较。只有野生型dUTX才能去甲基化H3K27me3，这表明所观察到的酶活性是dUTX多肽固有的。
图2。
图2。
体内脱甲基酶活性。（A） Western blot证明抗dUTX抗体（α-dUTX）可识别全长dUTX蛋白。用dUTX杆状病毒感染SF21细胞，并用亲和纯化的识别dUTX的兔多克隆抗体进行检测。将来自未感染（−）和dUTX病毒感染（+）细胞的两种不同数量的全细胞提取物加载到凝胶上。（B到G）dUTX抗体用于证明在RNAi后dUTX蛋白水平的降低果蝇属第三颗星幼虫。用抗dUTX抗体（D和G）对对照（B到D）或RNAi（E到G）幼虫的唾液腺进行免疫染色。对照和dUTX击倒幼虫的HP1水平相当（C和F）。（B和E）相应的相控图像。（H） dUTX敲低的苍蝇中H3K27甲基化水平升高。增加总组蛋白含量的蛋白质印迹盖子用H3K27甲基化抗体和总组蛋白H3抗体检测RNAi敲除（RNAi ON）或对照（RNAi OFF）果蝇。
图3。
图3。
用RNA聚合酶II的伸长形式（A到D）对dUTX进行克隆化，与接合但暂停的形式（E到H）形成对比。（B） 负责RNA聚合酶延伸形式的Ser2-磷酸化CTD。（C和G）dUTX在多线染色体上的免疫定位。（D） 面板B和C的合并，显示Ser2-磷酸化Pol II和dUTX的共定位。（F） 为Pol II参与但暂停的Ser5-磷酸化CTD支付费用。（H） 面板F和G的合并，仅显示部分同位化。（A和E）相应的相控图像。
图4。
图4。
dUTX被招募用于热休克基因。（A） 热休克（无热休克[NHS]）前和热休克（HS）5分钟后，用dUTX或RNA聚合酶（单克隆抗体8WG16）从Schneider 2（Dmal-2）细胞进行染色质免疫沉淀。热休克基因的引物1 kb用于测量热休克基因对dUTX和Pol II的补充。Rp49水平显示用于比较。免疫沉淀物中回收的输入DNA的百分比显示为年轴。误差条表示两个实验的范围。（B到E）dUTX在果蝇属唾液腺。（B） 相位对比图显示了主要热休克部位的肿胀，如箭头所示。（C到E）dUTX（C）和Pol II（D）的伸长、Ser2-磷酸化形式在B组所示的三个热休克位点上共定位（E）。（F）使用两种不同的dUTX抗体或免疫前血清（Pre-Im）进行免疫沉淀分析果蝇属核提取物。用单克隆抗体8WG16检测Pol II与dUTX的相互作用。
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参考文献

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