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。2008年2月；9(2):215-29.
doi:10.1111/j.1600-0854.2007.00680.x。 Epub 2007年12月18日。

APPL1和APPL2的膜靶向作用：寡聚并结合磷脂酰肌醇的动态支架

海蒂·J·恰尔 1, 吴汝平, 卡罗琳·乌斯塔奇, 琳达·C·麦克菲尔, 威廉·莫布里, Yong Q Chen（陈勇强）
附属机构

APPL1和APPL2的膜靶向作用：寡聚并结合磷脂酰肌醇的动态支架

海蒂·J·恰尔等。 交通。 2008年2月。

勘误表in

  • 交通。2008年4月；9(4):623-4

摘要

人类衔接蛋白、磷酸酪氨酸相互作用、PH域和含1亮氨酸拉链（APPL1是小鸟嘌呤三磷酸酶RAB5的同源效应器，与一组不同的受体和信号蛋白相互作用，并被认为在内体介导的信号传递中发挥作用。在此，我们研究了APPL1和APPL2 Bin/Amphiphysin/Rvs（BAR）、pleckstrin同源性（PH）和磷酸酪氨酸结合（PTB）结构域的膜靶向性。协同免疫沉淀和酵母双杂交研究表明，全长APPL蛋白形成同源寡聚体和异源寡聚物，并且APPL最小BAR结构域对于介导APPL-APPL相互作用是必要的和充分的。当融合到荧光蛋白并过度表达时，所有三个域（最小BAR、PH和PTB）都以细胞膜为靶点。此外，与磷酸肌醇结合的全长APPL蛋白以及APPL分离的PH或PTB结构域足以进行体外磷酸肌醇结合。活细胞成像显示，全长APPL-yellow荧光蛋白（YFP）融合蛋白与经历运动、融合和裂变事件的细胞膜结构相关。全长APPL-YFP融合蛋白的过度表达足以招募内源性RAB5以扩大APPL相关膜结构，尽管APPL1对RAB5膜靶向不是必需的。综上所述，我们的研究结果表明，APPL蛋白作为动态支架发挥作用，通过其进行结构域介导的寡聚化、膜靶向和磷脂酰肌醇结合的能力，调节RAB5相关的信号内体膜。

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数字

图1
图1。最小BAR域对于介导同型和异型APPL-APPL相互作用是必要的和充分的
A） 为APPL1（1-1至1-12）和APPL2（2-1至2-12）生成了12个猎物构造。诱饵构造包括全长APPL1（1-FL）和APPL2（2-FL）及其各自的最小BAR域（1-BAR和2-BAR）。B） 将含有所有可能的诱饵和猎物蛋白组合的二倍体酵母菌株印在控制板（对照）上或印在需要诱饵与猎物蛋白相互作用的板上（Ade-伊斯-). 将空的猎物载体与每个诱饵蛋白共存的二倍体（V，每个板的顶行）和将层粘连诱饵与每个猎物蛋白共存的二倍体（层粘连毒饵）作为阴性对照。C） 酵母双杂交图谱数据摘要。
图2
图2。APPL1和APPL2表现出同型和异型蛋白质相互作用体内
在转染后24小时收集DLD-1细胞的全细胞裂解物，并使用指示的抗体[小鼠抗YFP单克隆抗体（YFP）、小鼠抗V5单克隆抗体或小鼠IgG对照（IgG）]进行免疫沉淀实验。所示为用抗APPL1（A和C）、抗APPL2（B）或抗V5（B和C）抗体探测的全细胞裂解物（Lys）和免疫沉淀物（IP）的IBs。A） APPL1与APPL1-YFP共免疫沉淀。用载体转染细胞以过度表达YFP作为阴性对照或用载体过度表达APPL1-YFP。B） APPL2-YFP与APPL2-V5-H共免疫沉淀，反之亦然。将细胞与过表达YFP和APPL2-V5-His的载体共转染作为阴性对照（1），或与过表达APPL2-YFP和APPL2-V5-His的载体共转染（2）。C） APPL1-YFP与APPL2-V5-H共免疫沉淀，反之亦然。细胞与载体共转染以单独过度表达YFP，APPL2-V5-His作为阴性对照（1），或与载体共感染以过度表达APPL1-YFP和APPL2-V5-His（2）。
图3
图3。APPL1和APPL2最小BAR结构域定位于细胞膜结构并影响细胞形态
用载体转染DLD-1细胞以过度表达（A）仅YFP（B）全长APPL1-YFP。转染后24小时将盖玻片上生长的细胞固定，并测定YFP融合蛋白的定位。显示了每个细胞的YFP自体荧光、DAPI染色和DIC图像。棒材，10μm。
图4
图4。APPL1和APPL2蛋白表现出PH和PTB结构域介导的磷脂酰肌醇结合在体外和膜靶向体内
A） 蛋白质覆盖实验是通过将含有100-pmol点指示脂质的PIP条带（Echelon Biosciences，Inc.）与纯化的细菌表达的GST融合蛋白孵育，然后用抗GST抗体进行探测，与HRP结合的二级抗体孵育并使用增强化学发光检测。Multi-PIP GRIP™和PIP2 GRIP™（Echelon Biosciences，Inc.）的混合物结合到所有磷酸化的PIP上，作为阳性对照，而GST单独作为阴性对照（GST），以确保结合不受GST标签的介导。测试对应于APPL1或APPL2全长蛋白的纯化GST融合蛋白及其各自分离的PH结构域或分离的PTB结构域的PIP结合。B-F）所示为生长在盖玻片上并在转染后24小时固定的DLD-1细胞的标准荧光显微镜图像，以检查过度表达的（B）CFP单独或N末端CFP与（C）APPL1分离PH域（CFP-APPL1 PH）、（D）APPL2分离PH域（CFP-APPL2 PHAPPL1分离PTB结构域（CFP-APPL1 PTB）和（F）APPL2分离PTBdomain（CFP-APPL2 PTB。显示每个细胞的CFP自体荧光、DAPI染色和DIC图像。棒材，10μm。溶血磷脂酸；溶血磷脂；PI、PtdIns；PE，磷脂酰乙醇胺；磷脂酰胆碱；PA，磷脂酸；PS，磷脂酰丝氨酸。
图5
图5。APPL-YFP融合蛋白的过度表达导致内源性RAB5向细胞膜结构募集
用载体转染DLD-1细胞，使其过度表达APPL1-YFP或APPL2-YFP.转染后24 h将细胞固定。使用抗RAB5抗体和德克萨斯州Red-conjugated二级抗体的间接免疫荧光显微镜显示，内源性RAB5与（a）APPL1-YFP和（B）APPL2-YFP在增大的细胞膜结构上共定位（白色表示重叠）。C） DLD-1全细胞裂解物的IB用这些实验中使用的小鼠单克隆抗RAB5抗体进行探测，显示长时间和短时间接触相同的印迹（分别为左和右）。棒材，10μm。
图6
图6。RAB5膜靶向不需要APPL1
用NS siRNA试剂、APPL1 siRNA试剂或模拟转染细胞。在siRNA转染后2.5天，对细胞进行复制（A）以进行IB分析，以检测APPL1、RAB5和肌动蛋白水平（每个孔负载20μg总蛋白），（B）在血清刺激15分钟后，盖玻片检查饥饿细胞中内源性RAB5和APPL1的定位（左下方插图显示放大的细胞区域，用“>”表示，“*”表示APPL siRNA面板下方的非iRNA抑制细胞）或（C）用于转染的盖玻片，以检查CFP-RAB5和内源性APPL1定位（在较低的APPL1 siRNA面板中，“>”表示siRNA抑制细胞，“*”表示非iRNA抑制细胞）。收集裂解物，并在siRNA转染后4.5天固定细胞。棒材，10μm。
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