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。2007年11月20日；104(47):18439-44.
doi:10.1073/pnas.0707292104。 Epub 2007年11月14日。

JmjC结构域UTX和JMJD3作为组蛋白H3赖氨酸27脱甲基酶的鉴定

Sunhwa Hong公司 1, Young-Wook Cho（音）, 李荣余, 洪宇, 蒂莫西·德文斯特拉, Kai Ge公司
附属公司

JmjC结构域UTX和JMJD3作为组蛋白H3赖氨酸27脱甲基酶的鉴定

Sunhwa Hong公司等。 美国国家科学院程序。 。

摘要

组蛋白的共价修饰，如乙酰化和甲基化，在基因表达调控中起着重要作用。组蛋白赖氨酸甲基化与基因激活和抑制有关，这取决于被甲基化的特定赖氨酸（K）残基和甲基化状态（单、二或三甲基化）。组蛋白H3在K4、K9和K36上的甲基化已被证明是可逆的，并且可以通过位点特异性去甲基化酶去除。然而，对抗组蛋白H3（H3K27）K27甲基化的酶，这是一种对胚胎干细胞维护、多囊介导的基因沉默和X染色体失活至关重要的表观遗传标记，目前尚不清楚。这里我们展示了JmjC结构域包含蛋白UTX（普遍转录的四肽重复序列，X染色体）以及相关的JMJD3（jumonji结构域包含3），在体外可以特异性地去除H3K27上的甲基标记。此外，UTX的脱甲基酶活性需要一个催化活性的JmjC结构域。最后，UTX和JMJD3的过度表达导致H3K27在细胞中的二甲基化和三甲基化减少，这表明UTX和JJD3可能在体内起到H3K17脱甲基酶的作用。UTX和JMJD3作为H3K27特异性去甲基化酶的鉴定提供了直接证据，表明与组蛋白H3的K4、K9和K36上的甲基化类似，H3K17上的甲基化度也是可逆的，并且可以通过位点特异性组蛋白甲基转移酶和去甲基化酶类进行动态调节。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
UTX特异性去甲基化组蛋白H3K27在体外. (A类)具有六个TPR（四肽重复序列）结构域和一个JmjC结构域的人UTX蛋白的示意图。(B类)纯化UTX蛋白的考马斯蓝染色。用表达FLAG和myc标记UTX或仅表达载体（Vec）的质粒转染293T细胞。用含1%Nonide P-40的缓冲液制备全细胞提取物，并与抗FLAG M2琼脂糖孵育。广泛洗涤后，用FLAG肽洗脱结合蛋白，在SDS/PAGE上解析4–15%，然后进行考马斯蓝染色。IP，免疫沉淀。M、 蛋白质标记物。(C类)在组蛋白脱甲基酶分析中，对应于≈1μg纯化UTX的洗脱液与2.5μg小牛核心组蛋白孵育。检测产品通过Western blotting进行分析，抗体显示在右侧。如图所示，me1为单甲基，me2为二甲基，me3为三甲基。(D类)对越来越多的纯化UTX进行组蛋白去甲基化酶分析。(E–G公司)UTX对H3K27me3活性的质谱分析(E类)，H3K27me2(F类)和H3K4me3(G公司)肽。在组蛋白去甲基化酶分析中，将3微克UTX与1微克肽孵育，然后进行MALDI-TOF质谱分析。H3K27me3、H3K17me2和H3K4me3肽的质量分别为2958.7、2944.7和1189.7Da。
图2。
图2。
UTX的H3K27脱甲基酶活性需要一个催化活性的JmjC结构域。(A类)TPR结构域是H3K27me1上UTX的最佳脱甲基酶活性所必需的，但对于H3K17me2/3上的UTX活性是不必要的。(上部)人类UTX蛋白全长和401-1401 aa片段的示意图。指出了保守Fe（II）结合H1146在JmjC催化结构域中的位置。(下部)表达全长或401-1401 aa片段的FLAG-tagged UTX质粒转染到293T细胞中，然后对小牛核心组蛋白进行蛋白质分离和组蛋白去甲基化酶分析，如图1所示。IP，免疫沉淀。(B类)JmjC结构域中Fe（II）结合H1146的突变消除了UTX的H3K27脱甲基酶活性。将表达FLAG标记的野生型或H1146A突变UTX的质粒转染到293T细胞中，然后进行如上所述的蛋白质分离和组蛋白去甲基化酶分析。
图3。
图3。
野生型UTX而非H1146A突变的过度表达导致细胞中H3K27甲基化降低。转染myc标记野生型或H1146A突变型UTX的COS-7细胞用抗myc和抗H3K27me3染色(A类)，抗H3K27me2(B类)，或抗H3K27me1抗体(C类). 绿色对应于抗myc抗体染色；红色对应于特定甲基化抗体染色；蓝色对应细胞核的DAPI染色。对UTX过度表达的细胞（箭头所示）在显微镜下对H3K27me3、H3K17me2和H3K24me1的信号强度进行评分，定量结果如表1所示。实验被重复至少三次，并显示了具有代表性的结果。
图4。
图4。
JMJD3是一种H3K27特异性脱甲基酶。(A类)UTX、UTY和JMJD3的蛋白质序列比对示意图，显示了与UTX的序列相似程度。蛋白质序列的一致性显示在括号中。含有1174-1636 aa的JMJD3的JmjC域与含有931-1394 aa的UTX的JmjC域具有84%的序列相似性。(B类)JMJD3特指去甲基化H3K27me2和H3K17me3在体外将表达FLAG标记JMJD3的质粒转染到293T细胞中，然后对小牛核心组蛋白进行蛋白质分离和组蛋白去甲基化酶分析，如图1所示。(C类)纯化的UTY蛋白没有H3K27脱甲基酶活性在体外将表达FLAG标记UTY或UTX的质粒转染到293T细胞中，然后进行蛋白质分离和组蛋白脱甲基酶分析，如图1所示。大约120 ng纯化的UTX和UTY蛋白用于小牛核心组蛋白的脱甲基酶分析。(D类)JMJD3的过度表达导致细胞内H3K27me2/3降低。转染myc标记JMJD3的COS-7细胞用抗myc（绿色）和抗H3K27me3染色(上部，红色）或抗H3K27me2(下部，红色）抗体，如图3所示。箭头指向JMJD3过度表达的细胞。
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