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.2007年12月；81(6):1232-50.
doi:10.1086/522238。 Epub 2007年10月31日。

启动子占用率的高通量分析揭示了FOXP2的直接神经靶点，FOXP2是言语和语言障碍中突变的基因

Sonja C Vernes公司 1, 伊丽莎白·斯皮特里, 杰罗姆·尼科德, 马蒂亚斯·格罗泽, 詹妮弗·泰勒, 凯·E·戴维斯, 丹尼尔·盖什温德, 西蒙·费希尔
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启动子占用率的高通量分析揭示了FOXP2的直接神经靶点，FOXP2是言语和语言障碍中突变的基因

Sonja C Vernes公司等人。 美国人类遗传学杂志. 2007年12月.

摘要

我们之前发现，人类FOXP2基因的突变会导致单基因沟通障碍，其主要特征是难以学习做出协调的发音手势序列，而这正是言语的基础。受影响的人在表达和接受语言处理方面存在缺陷，大脑皮层和皮层下区域出现结构和/或功能异常。FOXP2为了解语音和语言中涉及的神经过程提供了一个独特的窗口。特别是，它作为转录因子基因的作用为剖析关键的神经遗传机制提供了强大的功能基因组途径。在这里，我们利用染色质免疫沉淀结合启动子微阵列（ChIP-ChIP）成功地鉴定了人类神经样细胞天然染色质中与FOXP2蛋白直接结合的基因组位点。我们将重点放在通过该方法确定的下游靶点子集上，表明改变的FOXP2水平在我们的基于细胞的模型中产生了显著的表达变化，并且FOXP2以特定的方式与相关启动子内的共识位点结合。此外，我们还证明了突变小鼠胚胎脑中目标表达的显著数量差异，这是由体内特定Foxp2染色质相互作用介导的。这项工作代表了首次识别和体内验证FOXP2调节的神经靶点。我们的数据表明，FOXP2具有双重功能，可以抑制或激活被占领启动子的基因表达。已确定的靶点表明了其在调节突触可塑性、神经发育、神经传递和轴突导向方面的作用，并代表了在言语和语言障碍中可能受到干扰的体内通路的新切入点。

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数字

图1。
图1。
ChIP-ChIP技术概述。活细胞通过甲醛处理交联，以保持转录因子和靶DNA之间的相互作用。细胞裂解后，基因组DNA被剪切成约0.5–1 kb的片段。在这个阶段，取下一小份作为“输入”参考DNA。使用指向FOXP2 N末端的抗体免疫沉淀染色质片段。免疫沉淀样品和输入样品中的交叉链都是热反转的。在DNA纯化并用荧光染料标记后，样品被应用于含有数千个人类启动子片段的微阵列。启动子显示正折叠变化的基因可以使用生物信息学分析。通过qRT-PCR表达分析和DNA结合分析在逐个基因的基础上进行功能验证。
图2。
图2。
FOXP2高通量定位分析中富集的基因的GO聚类。GOTrees显示GO分类在303个基因的目标列表中过度出现，以及类别之间的关系，涉及分子功能和生物过程。人数明显过多的类别(P（P）<.05)以黑色突出显示。
图3。
图3。
目标基因的网络分析。使用灵巧路径分析生成交互网络。图中显示了通过该方法确定的一个重要功能途径的示例，该途径以Wnt/β-catenin和IGF-1信号通路为中心。灰色阴影的基因被鉴定为显著(P（P）<.05)丰富了ChIP-ChIP分析；其他人是根据Ingenuity知识数据库中的关系加入这一途径的。实线和虚线分别表示直接和间接的相互作用。节点形状代表分子类别，垂直菱形代表酶，水平菱形代表肽酶，椭圆代表转录因子，正方形代表细胞因子，三角形代表激酶，六边形代表翻译因子，圆圈代表其他类别。有关更多信息，请访问Ingenuity Systems网站。
图4。
图4。
生物信息学富含FOXP2 ChIP-ChIP的序列的基序分析。A、，评估表3中基因启动子区域中已知FOX（TRTTKRY）、FOXP（TRTTTRY）或FOXP2（[A]ATTTG[T]）结合位点的存在。维恩图表示包含至少一个这些结合位点的启动子序列的数量，包括重叠，其中在同一序列中存在不止一类位点。在启动子中，70个包含至少一个完美的FOXP2、FOXP或FOX结合位点，大多数（61%）包含多类共有位点。所有启动程序都至少有一个FOXP2绑定站点包含一个不匹配。B、，结合位点的数量和意义。表示所有序列中识别的结合位点总数，并根据位点类别和识别数据集中每个位点的统计意义进行分区。NS=不显著。C、，无偏基序分析结果。从分析的100个靶序列中发现的过度表达的基序包括与FOX家族一致性结合位点非常相似的基序1，以及与UBP1（也称为“LBP-1a”）一致性结合部位紧密或精确匹配的基序2和3。
图5。
图5。
通过表达分析对FOXP2靶点进行功能验证。对稳定的SH-SY5Y细胞株制备的cDNA进行qRT-PCR(A类)或瞬时转染的SH-SY5Y细胞(B类). 表达式更改(X（X）-轴）表示为对数平均值2将转染FOXP2的细胞与转染空白载体对照的细胞的表达比率进行比较，并对内部对照的表达进行标准化，GAPDH公司值是稳定细胞系的七种独立cDNA制剂和瞬态细胞系的六种独立cNA制剂的比较平均值。误差线表示±SEM。P（P）值是使用双尾非配对t吨测试。四个星号（****）表示P（P）<.0001，三个星号（***）表示P（P）<.001，两个星号（**）表示P（P）<.01，一个星号（*）表示P（P）<.05在稳定细胞系中观察到的大多数表达变化在瞬时转染细胞中得到证实。热休克蛋白B7在瞬时细胞系中无法检测到表达；因此，无法在该系统中评估表达变化。
图6。
图6。
通过DNA结合对FOXP2靶点进行功能验证。EMSA用于确定FOXP2和已在表达分析中测试的靶点的启动子区域之间的直接相互作用。探针的设计基于启动子阵列上代表的区域和FOX（P）共识结合位点的存在（表5）。A类和B、，FOXP2与靶探针结合，首次使用HEK293T细胞核建立。用空白载体假转染HEK293T细胞核（HEK293细胞表达低水平内源性FOXP2）或FOXP2转染细胞核（用星号[*]表示）培养放射性标记探针。指示FOXP2和放射性标记探针之间相互作用引起的位移位置(箭头).C、，通过EMSA证实与纯化的FOXP2蛋白结合到靶探针，其结果与HEK293T细胞核中的结果相似。在面板A-C中，FOXP2与已知共识结合位点（consensus）的结合显示为阳性对照。D中，对SLC17A3-1探头进行了更详细的分析。结合测定是在存在来自未标记探针的竞争的情况下进行的。FOXP2与标记探针的结合通过与未标记竞争探针（SLC17A3）的竞争而被有效削弱，超过5倍或10倍，显示出相互作用的特异性。核心结合位点的突变导致未标记探针（SLC17A3M）缺乏竞争，这表明了FOXP2结合碱基的重要性。一个一致的FOXP2结合位点显示出轻微的竞争，而一个无关的启动子序列（NFK）在5倍或10倍的过量时无法竞争结合。添加一种针对FOXP2（Ab）的抗体会破坏复合物的形成。这证实了引起凝胶阻滞的蛋白质的身份是FOXP2，使用纯化的FOXP2蛋白质进一步验证了这一结果。
图7。
图7。
Foxp2与靶基因的结合及靶基因在胚胎小鼠脑内的体内表达调控。A、，体内启动子占有率分析。FOXP2 ChIP是使用野生型小鼠（WT）或因外显子7无义突变而缺乏FOXP2蛋白的纯合子突变同胞（MUT）E16的全脑进行的（参见“材料和方法”部分）。使用引物对DNA进行PCR扩增Slc17a3、Cer1、Psen2、，或β-肌动蛋白控制启动子区域。的发起人Slc17a3系列和证书1与来自突变大脑的ChIP样品相比，从野生型大脑中分离的ChIP样本中特异性富集。凝胶是三次重复实验的代表性结果。IP代表免疫沉淀样品。B、，的表达式第17a3页显示与的反向关系Foxp2系列E16小鼠大脑中的表达。用五个野生型和五个突变型全脑样本产生的cDNA进行RT-PCR。请注意Foxp2系列在突变小鼠中是非传感介导RNA衰变的结果；此外，潜在的截短产物高度不稳定，导致缺乏可检测的Foxp2蛋白（M.G.、J.N.和S.E.F.，未发表的数据）。表达式更改表示为日志平均值2用于比较野生型和突变型小鼠的表达率，并将其归一化为内部对照的同等表达，盖普德。使用双尾非配对方法计算统计显著性t吨测试。两个星号（**）表示P（P）<.01; 四个星号（****）表示P（P）<.0001.C、，独立小鼠样品体内表达变化的确认。使用从一对独立的野生型和突变型小鼠大脑中制备的样品进行标准RT-PCR显示，对Slc17a3系列在突变体中。
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