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.2007年11月；3（11）：e166。
doi:10.1371/journal.ppat.0030166。

EBV潜伏膜蛋白1激活B细胞淋巴瘤中的Akt、NFkappaB和Stat3

凯西·H·Y·谢尔 1, 凯瑟琳·本特, 瑞秋·H·爱德华兹, 伊丽莎白·C·贝德福德, 朱迪斯·尼尔森, 南希·拉布·特劳布
附属公司

EBV潜伏膜蛋白1激活B细胞淋巴瘤中的Akt、NFkappaB和Stat3

凯西·H·Y·谢尔等。 公共科学图书馆-病理学. 2007年11月.

摘要

潜伏膜蛋白1（LMP1）是EB病毒（EBV）的主要癌蛋白。在转基因小鼠中，LMP1促进了12个月大时淋巴瘤的发展。这项研究表明淋巴瘤发生在B-1a淋巴细胞中，这是一个与老年小鼠转化相关的群体。淋巴瘤细胞具有放松调控的细胞周期标记物，Akt、NFkappaB和Stat3抑制剂阻断LMP1转基因淋巴细胞和淋巴瘤细胞在体外增强的生存能力。淋巴瘤细胞的生存和增殖独立于IL4/Stat6信号，但具有组成性激活的Stat3信号。这些相同的靶点在野生型B-1a淋巴瘤中也被解除了调控，这些淋巴瘤是通过年龄倾向自发产生的。这些结果表明，Akt、NF-kappaB和Stat3途径可能是治疗EBV相关B细胞淋巴瘤的有效靶点。

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数字

图1
图1。LMP1高表达与淋巴瘤的发生发展
LMP1表达通过（A）纯化B细胞（CD19+）的免疫印迹和（B）野生型（WT）和LMP1转基因小鼠脾组织的免疫组织化学染色显示。（A） 淋巴瘤以数字（1-7）进行识别。箭头表示LMP1特异性带及其降解产物以及非特异性带。肌动蛋白被用作加载控制。（B） 图示为白色和红色牙髓，但这种结构随着淋巴瘤的发展而消失。比例尺，20μm。
图2
图2。LMP1促进B-1a淋巴瘤逃避等位基因排斥
（A） 流式细胞术分析WT或LMP1转基因淋巴瘤脾细胞的pan–B细胞（CD19）、B-1a细胞（CD5）、Ig重链（IgM和IgD）和轻链（κ和λ）标记。所示为WT淋巴瘤1和LMP1转基因淋巴瘤4的结果。对其他四个显示类似B-1a表型的LMP1转基因淋巴瘤（1、2、3和6）重复此分析，其中淋巴瘤2和4的κ和λ轻链也呈双重阳性。（B） 流式细胞术分析B-1a（CD19+CD5+）和B-1b或B2亚群（CD19+CD5−）的WT或LMP1转基因脾细胞。B-1a和B-1b或B2子集的百分比显示在每个象限中。在另外三只WT和另外两只LMP1转基因小鼠上重复此分析，结果相似。（C） 对从WT和LMP1转基因小鼠纯化的B细胞（CD19+）的κ和λ轻链进行免疫印迹分析。肌动蛋白被用作加载控制。
图3
图3。LMP1促进B细胞体外存活和增殖
（A） WT和LMP1转基因小鼠脾细胞的MTS分析。脾细胞在IL4存在（灰色条）或不存在（黑色条）的情况下培养3天。结果是多只小鼠三份样品的平均值±SEM，其中“n”所分析的小鼠数量如下：n个=2，对于WT淋巴细胞和WT淋巴瘤，n个=11，对于LMP1转基因淋巴细胞，以及n个LMP1转基因淋巴瘤=13。（B） EMA排除WT和LMP1转基因小鼠的CD19+门控脾细胞，显示有（白色条）或无（黑色条）IL4培养2天的活B细胞百分比。所示为WT淋巴瘤1和LMP1转基因淋巴瘤2的结果。显示了每个象限中的单元格百分比。
图4
图4。野生型和LMP1转基因淋巴瘤细胞的存活与IL4/Stat6信号转导无关
（A） 对来自WT和LMP1转基因脾细胞的纯化B细胞（CD19+）的IL4mRNA的Rnase保护测定。L32和GAPDH看家基因被用作负荷控制。箭头指示受保护探头的位置。（B和C）WT和LMP1转基因小鼠在收获时在（B）纯化的B细胞（CD19+）中或在（C）有或没有IL4培养的全脾细胞中激活pStat6的免疫印迹分析。（B） Actin被用作装载控制，白线表示中间车道已拼接。（D）WT淋巴细胞和（E）LMP1转基因淋巴瘤细胞的（D和E）MTS分析，这些细胞与IL4、IL4中和抗体或指示浓度的大鼠IgG同型对照培养。所示为LMP1转基因淋巴瘤3的结果。结果是重复两次具有类似结果的单个代表性实验中三份样品的平均值±SEM。
图5
图5。LMP1上调IL10表达并组成性激活Stat3
（A） 用Rnase保护试验检测WT和LMP1转基因B细胞（CD19+）中IL10、IL15和IFNγmRNA的相对表达。以小鼠淋巴瘤细胞系967和K46μ为对照。用荧光成像仪定量表达水平，并将数值归一化为核糖体管家基因L32。在小鼠B细胞淋巴瘤细胞系967中，细胞因子：L32比率设置为1。（B和C）收获时WT和LMP1转基因小鼠（B）纯化的B细胞（CD19+）中激活的pStat3的免疫印迹分析，以及（C）加入或不加入IL10、IL10中和抗体或大鼠IgG1同型对照品培养4小时后的免疫印记分析。（C） 显示WT淋巴瘤1和LMP1转基因淋巴瘤1的结果。箭头表示Stat3的α和β亚型的位置。肌动蛋白被用作加载控制。（D） WT和LMP1转基因小鼠脾脏中活化核pStat3的免疫组织化学检测。比例尺，20μm。
图6
图6。LMP1激活Akt信号传导并解除对Rb细胞周期通路的调节
（A和B）对来自WT和LMP1转基因小鼠脾脏的纯化B细胞（CD19+）进行Akt信号的免疫印迹分析，探测（A）激活的pAkt和下游靶点，包括失活的pGSK3α/β和（B）激活的p-mTOR，以及FoxO1的总水平。箭头表示GSK3α和β亚型的位置。白线表示中间车道已拼接。（C） 免疫印迹分析调节Rb通路的细胞周期蛋白，探测活化的pRb，以及Cdk2和Cdk抑制剂p27的总水平。肌动蛋白被用作加载控制。
图7
图7。淋巴瘤细胞的生长和生存需要Akt、NFκB和Stat3信号
MTS分析来自（A和B）WT或（C和D）LMP1转基因淋巴瘤和（E和F）LMP1-转基因淋巴瘤的脾细胞。在指定浓度下，在有或无NFκB抑制剂（BAY11）、mTOR（雷帕霉素）、Akt（三氯立滨）、MEK1/2（U0126）、p38（SB202190）或Stat3（葫芦素I和AG490）的情况下培养脾细胞。结果是三份样品的平均值±SEM。所示为分析的（A和B）WT淋巴瘤1、（C和D）LMP1转基因淋巴瘤2和（E和F）两个LMP1基因转基因小鼠中的一个的结果。用LMP1转基因淋巴瘤4重复该分析，得到类似的结果。
图8
图8。Akt、NFκB和Stat3通路在淋巴瘤细胞生长和存活中的作用分析
（A–D）用（A）Akt抑制剂、三氯立滨、（B）NFκB抑制剂、BAY11–7085和Stat3抑制剂（C）葫芦素I和（D）AG490在指定浓度下治疗后，对野生型和LMP1转基因淋巴瘤进行Akt、NF-κB和Stat3信号的免疫印迹分析。箭头表示Stat3的α和β亚型的位置。肌动蛋白被用作加载控制。
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