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.2007年11月；12(5):432-44.
doi:10.1016/j.ccr.2007.10.014。

核小体占据在MLH1-CpG岛表观遗传沉默中的作用

乔伊·C·林 1, 真武（Shinwu Jeong）, 梁刚宁, Daiya Takai公司, Merhnaz Fatemi公司, 伊冯·蔡, 格尔达·艾格, 艾纳夫·尼利·加尔·亚姆, 彼得·琼斯
附属公司

核小体占据在MLH1-CpG岛表观遗传沉默中的作用

乔伊·C·林等。 癌细胞. 2007年11月.

摘要

抑癌基因的表观遗传沉默通常被认为涉及DNA胞嘧啶甲基化、组蛋白共价修饰和染色质致密化。在这里，我们表明，癌症细胞中双向MLH1启动子CpG岛中三个转录起始位点的沉默涉及核小体占有率的显著变化。在甲基化和沉默的启动子上存在三个几乎完全不存在于正常细胞起始位点的核小体，这表明表观遗传沉默可以通过将核小体稳定地放置在先前的空缺位置来实现。通过5-氮杂-2’-脱氧胞苷去甲基化激活启动子涉及核小体驱逐。抑癌基因的表观遗传沉默可能涉及胞嘧啶甲基化引起的核小体占有率的可遗传变化。

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数字

图1
图1。双向启动子甲基化状态与基因表达模式的相关性EPM2AIP1和MLH1型
（A） 双向启动子和CpG岛。水平箭头显示通过5′-RACE分析确定的转录起始位点，黑框显示各自的第一个外显子。黑色勾号表示CpG二核苷酸。勾号下方的水平条表示CpG孤岛。（B） 中三个CpG的平均甲基化水平EPM2AIP1/MLH1用Ms-SNuPE分析启动子区，用RT-PCR检测两个基因在正常人膀胱成纤维细胞株LD419和多种人肿瘤细胞株中的表达。β-肌动蛋白表达作为cDNA输入量的对照。RT作为无内含子基因的阴性对照，EPM2AIP1.
图2
图2。DNaseI消化法检测超敏位点
（A） 用增加浓度的DNaseI处理来自LD419和RKO细胞的基因组裸DNA和细胞核，然后纯化每个样本的DNA并用DraI处理，并用Southern blot分析消化产物。作为对照，使用裸DNA来确认酶缺乏序列特异性。如图所示，DraI处理前的消化样品通过凝胶电泳进行分离。（B） Southern blot分析显示EPM2AIP1/MLH1发起人。在左侧，按比例绘制，显示了由DraI消化产生的1399 bp DNA片段、转录起始位点（箭头）和探针片段（黑匣子）。数字以bp表示距离。
图3
图3。单核体DNA和ChIP分析的核小体耗竭
（A） 单核体DNA分析。用MNase对LD419和RKO的细胞核进行部分消化，反应混合物在蔗糖梯度上运行以分离单核体DNA。通过使用八个区域（a–h）的特异性引物，通过实时PCR分析单核细胞体DNA的富集情况，如图顶部的黑色矩形所示EPM2AIP1/MLH1表达LD419和不表达RKO和SW48细胞的启动子。用组蛋白H3和乙酰化组蛋白H3.抗体进行ChIP分析。如（A）所述，通过实时PCR分析免疫沉淀DNA。免疫沉淀DNA的比例计算为输入DNA的百分比。结果显示为来自两个独立染色质制剂的两个或三个实验的平均值（bar）±SD。
图4
图4。自然染色质对M.SssI的可及性EPM2AIP1/MLH1LD419细胞表达中的启动子区
从表达非甲基化LD419细胞中提取（A–C）细胞核，然后用M.SssI处理15分钟，然后进行亚硫酸氢盐基因组测序。为了避免在分析中引入偏差，进行了两个独立的亚硫酸氢顺序反应。分析中包括四种不同大小的PCR产物，用蓝色虚线表示。（A） 未经处理的细胞核。（B） 用M.SssI处理裸DNA。（C） 用M.SssI处理的细胞核。带圆圈的水平线表示在PCR扩增和克隆亚硫酸氢盐处理的DNA后测序的单个分子。实心圈，甲基化CpG二核苷酸；开环，非甲基化CpG二核苷酸。粉色条表示M.SssI无法到达的区域或斑块，表明存在核小体。补丁被定义为至少两个连续的非甲基化位点，每侧至少有两个连续甲基化的CpG位点（Fatemi等人，2005）。蓝色条显示假定的蛋白结合区域。
图5
图5。5-Aza-CdR基因激活后的染色质结构变化
用5-aza-CdR处理RKO细胞，然后在药物添加后72小时和44天采集细胞进行RT-PCR和ChIP分析。（A） 定量RT-PCR。表达水平用标准化β-肌动蛋白，用作输入cDNA的控件。一个负RT对照作为无内含子基因的阴性对照，EPM2AIP1（未显示数据）。结果显示为来自两个独立cDNA制剂的两个PCR的平均值（bar）±SD。（B） 组蛋白H3乙酰化模式（通过ChIP）。如所述，通过实时PCR分析免疫沉淀的DNA（图3B）。免疫沉淀DNA的比例计算为输入DNA的百分比。结果显示为来自两个独立染色质制剂的两个或三个实验的平均值（bar）±SD。
图6
图6。5-Aza-CdR处理对核小体的驱离作用
（A–E）RKO细胞用5-aza-CdR处理24小时，并在药物治疗开始后72小时和44天采集。提取经药物处理的RKO细胞的DNA和细胞核，然后进行M.SssI处理，然后进行亚硫酸氢盐基因组测序。（A和D）添加5-aza-CdR后72小时和（D）44天RKO细胞中启动子的去甲基化。（B） 自然染色质对M.SssI的可及性EPM2AIP1/MLH1药物添加72小时后RKO细胞中的1a启动子区域。为了筛选出不适合M.SssI处理的广泛甲基化分子，PCR分析是使用仅退火到非甲基化分子的选择性引物进行的。基本原理见正文。（C和E）对来自药物处理的RKO细胞的细胞核的M.SssI处理（C）在药物添加后72小时和（E）44天，然后用选择性引物进行亚硫酸氢盐基因组测序。分子和补丁的描述请参考图4。启动子区核小体缺失的DNA分子用蓝色框住。
图7
图7。表达水平与核小体缺失分子百分比的相关性
根据图5、6和7的结果绘制数据图表。表达减少与核小体缺失人群减少有关。
图8
图8。表生沉默的简化模型MLH1型基因
1a和1b的活性启动子在每个转录起始位点的上游耗尽至少一个核小体。在沉默状态下，1a和1b的非活性启动子被核小体占据。用5-aza-CdR处理会导致启动子区域的大量DNA去甲基化，尽管一些分子仍保持甲基化。虽然一些半甲基化的启动子分子仍可能被核小体占据，但在一些启动子分子中建立了无核小体区。基因的激活可能来自于这些在启动子中具有无核小体区的分子，尽管我们无法确定这一点。绿色代表带有活性标记的核小体。红色代表带有抑制标记的核小体。灰色代表占据半甲基化区域的核小体。开圆圈表示未甲基化的CpG二核苷酸，填充圆圈表示甲基化CpG双核苷酸。半甲基化的DNA显示为半填充的圆圈。Ac是指乙酰化的组蛋白尾部。
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