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.2007年11月15日；179(10):6770-82.
doi:10.4049/jimmunol.179.10.6770。

硫酸化鞘糖脂作为吞噬介质：SM4s增强凋亡细胞清除并调节巨噬细胞活性

佐兰·波波维奇 1, 罗杰·桑德霍夫, Tjeard P Sijmonsma公司, 西尔维娅·卡登, 理查德·詹尼曼, 伊娃·基斯, 埃德加·托恩, 弗兰克·奥奇巴赫, 尼克·普拉特, 安永会计师事务所, 赫尔曼·约瑟夫·格伦
附属公司

硫酸化鞘糖脂作为吞噬介质：SM4s增强凋亡细胞清除并调节巨噬细胞活性

佐兰·波波维奇等。 免疫学杂志. .

摘要

硫糖脂存在于多种细胞的表面。磺胺嘧啶SM4s在肺癌、肾癌和结肠癌中增加，并与不良预后相关，可能是由于肿瘤的免疫反应性低。由于巨噬细胞对恶性肿瘤的炎症浸润有显著贡献，我们推测SM4s可能调节巨噬细胞功能。我们研究了SM4s对凋亡肿瘤细胞摄取、巨噬细胞细胞因子谱和受体表达的影响。通过流式细胞术和显微镜分析，我们发现用SM4s包裹来自结肠和肾脏的凋亡小鼠癌细胞，可促进小鼠巨噬细胞在体内外的吞噬作用，其吞噬作用可达3倍。巨噬细胞与氧化或乙酰化低密度脂蛋白和马来化白蛋白的预孵育特别抑制了这种增加的能力，表明清道夫受体参与了这种相互作用。SM4s包被凋亡细胞的摄取显著增强了巨噬细胞TGF-β1的生成、P-选择素的表达和IL-6的分泌。这些数据表明，肿瘤内的SM4s可能促进凋亡细胞的清除，并改变肿瘤相关巨噬细胞的表型。

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利益冲突声明

披露

作者没有经济利益冲突。

数字

图1。
图1：在正常和癌变的人肾脏和结肠组织中都可以检测到硫化物。
A–D、人肾和结肠的冷冻样品组织经IHC分析。A类，光显微照片显示基底隐窝上皮（箭头）和表面上皮的硫苷染色（双箭头）正常结肠（徕卡，×400）。B类，冒号肿瘤组织显示出强烈的上皮内（箭头）硫苷阳性（徕卡，×200）。C，显示皮层的光显微照片正常肾脏。收集导管上皮（箭头）显示存在磺胺嘧啶。（徕卡，×200）。D类，硫化物表达（箭头）在肾细胞癌组织中，有阳性凋亡细胞（徕卡，×200).E类酸性鞘糖脂的TLC。分析了人肾和结肠的正常组织和癌组织。
图2。
图2：用staurosporine诱导C26和Renca细胞后，以及暴露于SM4s后成功涂抹SM4s，显示出晚期凋亡表型。
A类，C26细胞与staurosporine（1µM） 24小时PS暴露和膜渗透性用FITC-结合膜联蛋白V和PI进行流式细胞术检测，分别是。Annexin V/PI双阳性细胞被认为是晚期凋亡的。B类、凋亡C26细胞的电子显微镜照片具有明显的核凝聚和碎裂（蔡司，×30000）。B类和C，电子显微照片用10µM SM4。黄金颗粒结合山羊抗鼠抗体（粒径6 nm）用于磺胺嘧啶的可视化（箭头）。D–F型，凋亡如上所述制备C26细胞，旋转下来，用DRAQ5染色（细胞核），并用抗O4和AlexaFluor 488驴抗小鼠免疫染色IgG（H+L）单克隆抗体（SM4s）。F类，单个细胞的共焦图像显示磺胺嘧啶的优势膜定位（×5000）。数据包括呈现为绿色和蓝色通道的合并。G–L,用抗O4单克隆抗体对凋亡细胞进行免疫细胞化学分析。硫酸酯或载体（DMSO）处理的凋亡细胞的显微照片。G公司和J型、C26和Renca对照细胞（徕卡，×400）。H（H）和我，C26电池用10个µM SM4（徕卡，×400和×1000）。K（K），晚期凋亡Renca细胞涂有磺胺嘧啶（徕卡，×400）。我SM4的绑定到晚期凋亡（箭头）和早期凋亡（星形）Renca的质膜细胞（徕卡，×400）。
图3。
图3：用SM4或对照品处理的细胞的TLC。
细胞与SM4s、SM4g、硫酸胆固醇（CS）的指示浓度，或1-磷酸神经酰胺（C1P），并进行薄层色谱分析。A类，晚期凋亡C26脂质的色谱图(左边)和伦卡(正确的)处理过的细胞SM4或车辆。B类，硫苷与早期凋亡和存活的C26细胞及塞米诺利与晚期凋亡细胞的结合细胞。C，晚期凋亡C26细胞脂质的色谱图用CS和C1P处理。D类，晚期凋亡的C26细胞用荧光半乳糖神经酰胺（BODIPY-FL）培养C12-半乳糖脑苷）在37°C下1小时，并通过流量分析细胞术。柱状图显示半乳糖神经酰胺（GalCer）与凋亡细胞。
图4。
图4 SM4s对巨噬细胞吞噬凋亡C26细胞的作用。
A类和B类，对于体外吞噬试验，小鼠腹腔巨噬细胞与DiO-标记的SM4s阳性细胞共培养或无SM4s凋亡的C26在37°C下1小时，清洗，染色抗小鼠CD11b-PE抗体，流式细胞仪分析。或者，巨噬细胞在与无SM4s的SM4s共培养前直接接触SM4s凋亡的C26细胞。双阳性人群代表巨噬细胞参与凋亡C26的栓系和/或摄取。C，传真吞噬指数通过除以平均相对DiO荧光来计算巨噬细胞强度（密度图的上象限）和凋亡C26（右下象限）。D–F型体内FACS分析吸收实验。计算每只小鼠的巨噬细胞数量以确定恒比巨噬细胞：凋亡细胞（1:2）。G公司和H（H），巨噬细胞与凋亡细胞共培养预先孵育10个µM SM4s（SM4），半乳糖神经酰胺（GC）、硫酸胆固醇（CS）、塞米诺利（SM4g）、1-磷酸神经酰胺（C1P）、，或载体在37°C下放置1 h。通过流式细胞术分析吞噬作用。结果表示三个重复实验的平均值±SEM。通过配对评估统计差异t吨测试（例如体内数据）或Mann-WhitneyU型试验（体内数据）。*，对< 0,05; 和***，对<0,001.
图5。
图5：不同细胞系、不同凋亡诱导剂和不同凋亡阶段对凋亡细胞摄取的比较分析。
晚期凋亡C26环己酰亚胺诱导的细胞(左边)，晚期凋亡Renca星形孢菌素诱导的细胞(中间的)和早期凋亡C26电池(正确的)进行流式细胞术分析细胞表面的PS暴露和膜渗透性(上面的车道)以及单元大小和粒度(中间车道).如前所述，细胞用于FACS吞噬试验(底部车道). 图表中的数据表示为平均值±SEM三个重复实验。统计差异由成对的t吨测试*，对<0.05和**，对<0.01。
图6。
图6：共聚焦显微镜和SM4s增强巨噬细胞对凋亡细胞的摄取。
A类，DiO标记的凋亡细胞共培养巨噬细胞在37°C下放置1小时用Alexa-546磷脂（肌动蛋白）和DRAQ5染色的非消化凋亡细胞（细胞核），并用共焦显微镜观察。数据以红色显示和蓝色通道（分别为Alexa-546和DRAQ5；左边),绿色通道（DiO；中间的)、和合并(正确的).B类，高倍共焦巨噬细胞凋亡物质胞内定位的图像(×2500).C吞噬活性巨噬细胞的百分比通过划分DiO-阳性和阴性巨噬细胞的数量来计算，乘以100。D类，分析单个巨噬细胞的绿色荧光强度，作为吞噬强度的参数。巨噬细胞+C26样本巨噬细胞的平均绿色荧光强度被视为“标准”（100%）。单体荧光强度巨噬细胞以标准20个巨噬细胞的百分比计算对每个实验的条件进行了分析。所有数据均表示为平均值±三个重复实验的SEM。评估了统计差异作者：Mann-WhitneyU型测试*，对<0.05和***，对< 0.001.
图7。
图7：摄入SM4s的巨噬细胞吞噬体室中凋亡颗粒数量增加，显示凋亡C26。
小鼠腹膜巨噬细胞生长在放置在6孔板中的盖玻片上并共同培养37°C下凋亡细胞1小时，并进行超微结构观察电子显微镜分析。A类，凋亡的定量两组之间吞噬体内的颗粒（箭头所示）。密集凋亡凋亡细胞吞噬体（恒星）中的物质-SM4s吞噬巨噬细胞与对照组比较。B类和C，每个细胞中凋亡的含颗粒吞噬体数量巨噬细胞和含有凋亡物质的巨噬细胞百分比为评价的。结果以平均值±SEM表示，总共80个来自三个实验的巨噬细胞。统计差异由曼·希特尼U型测试。***，对<0.001.
图8。
图8：涂有SM4s的凋亡细胞摄取增加主要由清道夫受体SR-A介导。
A类，用DiO-标记的孵育前凋亡的C26细胞、巨噬细胞与一般清除剂孵育受体阻滞剂（OxLDL）、SR-a阻滞剂37°C，并进行流式细胞术分析。B类,马来化牛血清白蛋白（MBSA）作为SR-blocker和牛血清白蛋白作为对照对凋亡细胞的摄取。C，凋亡（ApoC26）与存活巨噬细胞对（ViaC26）细胞的摄取。数据以平均值±SEM表示三个重复实验。统计差异由成对的t吨测试*，对<0.05和**，对< 0.01.
图9。
图9转化生长因子的生物合成-β1吞噬SM4s后被巨噬细胞标记为晚期凋亡的C26细胞。
A类，巨噬细胞生长在6孔板中，与对照组和SM4s染色的凋亡C26孵育细胞4小时和12小时，并进行细胞内免疫染色转化生长因子-β1.具有百分比的代表性等高线图TGF公司-β1-阳性巨噬细胞铸币。B类，时间进程统计分析细胞内总TGF-β1表示4小时和12小时的时间点。C，巨噬细胞在6孔板中生长并共同培养C26细胞凋亡，SM4s阳性C26细胞，SM4s10µM） 或车辆在37°C下保持12小时。收集上清液并进行ELISA。数据表示平均值±三个重复实验的SEM。评估了统计差异通过配对t吨测试**，对< 0.01.
图10。
图10 SM4s阳性凋亡C26细胞的吞噬作用增加了小鼠腹腔巨噬细胞的IL-6分泌并增强了P-选择素的表达。
共培养后与凋亡细胞一起，巨噬细胞与抗小鼠CD11b:PE和抗鼠CD62P:FITC单克隆抗体。A类和B类、FACS巨噬细胞P-选择素表达分析。巨噬细胞群（CD11b）+)门控（R1）和P-选择阳性百分比（CD62P+)用流式细胞术检测巨噬细胞。C，巨噬细胞在6孔板中生长并共同培养C26细胞凋亡，SM4s阳性C26细胞，SM4s10µM） ，LPS（1µg/ml），或37°C下培养2小时共培养开始后12h用ELISA分析。数据表示平均值三个重复实验的±SEM。统计差异为成对评估t吨测试*，对<0.05; **,对<0.01，和***，对<0.001.
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