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.2008年1月；19(1):198-206.
doi:10.1091/mbc.e07-05-0430。 Epub 2007年10月31日。

胆囊收缩素在体内外激活胰腺钙调神经磷酸酶NFAT信号

格热戈兹·T·古尔达 1, 李立国, 李赛宏（Sae-Hong Lee）, Jeffery D Molkentin公司, 约翰·威廉姆斯
附属公司

胆囊收缩素在体内外激活胰腺钙调神经磷酸酶NFAT信号

格热戈兹·T·古尔达等。 分子生物学细胞. 2008年1月.

摘要

蛋白酶抑制剂诱导内源性胆囊收缩素（CCK）释放增加导致胰腺生长。这种反应已被证明是由磷酸酶钙调神经磷酸酶介导的，但其下游效应器尚不清楚。在这里，我们检测了分离的腺泡细胞和胰腺生长的体内模型中钙调神经磷酸酶调节的活化T细胞核因子（NFAT）的激活。内源性NFAT的Western blotting和胰腺腺泡中NFATc1-GFP的共焦成像显示，CCK剂量依赖性地刺激NFAT在0.5-1h内从细胞质向细胞核移位。这种定位变化与CCK诱导NFAT驱动荧光素酶报告子的激活有关，与钙离子载体和组成活性钙调神经磷酸酶诱导的定位变化相似，因为这些变化被免疫抑制剂FK506和CsA以及内源性蛋白抑制剂CAIN的过度表达所阻断。体内发生了类似的NFAT激活。胰腺生长伴随着核NFAT的增加，随后胰腺中NFAT-脱落酶的表达增加，但对CCK无反应的器官中没有。这些变化还需要钙调神经磷酸酶，因为它们被FK506阻断。我们得出结论，无论在体外还是在体内，CCK都以钙调神经磷酸酶依赖的方式激活NFAT。

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图1。
图1。
钙调神经磷酸酶调节NFAT基因（NFATc1-c4）在外分泌胰腺中的表达模式。（A） 使用NFATc1-c4基因特异引物对的半定量RT-PCR，如材料和方法.车道1，RT控制；车道2，肾脏；3号车道，肝脏；第4通道，胰腺，第5通道，胰腺腺泡，第6通道，腺泡细胞衍生的AR42J细胞系。环磷菌素A作为对照。（B） 蛋白质水平NFAT表达的Western blot分析。泳道1和2，胰腺腺泡的细胞质[C]和细胞核[N]提取物（30μg/泳道）；全胰腺第3和第4通道、C和N提取物（30μg/通道）；第5和第6道，Jurkat T细胞系的C和N提取物（阳性对照，15μg/道），为了清晰起见，稍微分开。采用亲环素A（CypA）作为负荷控制。
图2。
图2。
CCK的刺激导致内源性NFAT的核占有率增加。（A） 分离的腺泡细胞未经处理（CTL）或用1μM的A23187、10μM的卡巴胆碱和30或100 pM的CCK处理1小时。制备细胞质[C]和核[N]提取物，以30μg/lane的速率装载，并使用NFATc1-c3抗体进行Western印迹分析。图中显示了典型的斑点以及核（层粘连蛋白A/C）负载控制。分离经CCK处理的提取物（7–10道）的印迹以澄清。（B） 基于Western blot（如A所示）密度测量值的核占有率定量，并根据总蛋白进行调整，如材料和方法值是3-6个实验的平均值和SE*与对照组相比，p≤0.05。
图3。
图3。
CCK促进NFATc1-GFP的核移位。将分离的小鼠腺泡与107PFU/ml NFATc1-GFP或βgal/GFP腺病毒，装载DRAQ5核标记染料，并使用Olympus FluoView 500共焦显微镜在Cell-Tak涂层玻璃盖玻片上成像。（A） 用100 pM CCK处理30分钟之前（顶部）和之后（底部）单个分离小鼠腺泡的时间进程。（B） 用所列药物处理30分钟腺泡的样本图像。在使用FK506和CaCN的实验中，腺泡分别预处理30分钟和过夜。（C） 随机选择中等大小（5–20细胞）的DRAQ5负载的表达GFP的腺泡（约占所有腺泡细胞的95%），通过DRAQ5-和GFP的共定位来量化%的显示NFATc1信号的细胞核。数据是3-5个独立腺泡分离物的平均±SE，每个制剂至少10个腺泡的平均计数*与对照组相比，p<0.01。
图4。
图4。
CCK激活孤立腺泡细胞中的NFAT（体外）。分离的腺泡细胞用5×10培养6.5小时6PFU/ml NFAT-luc（NFAT-luk）腺病毒，经处理、裂解并检测荧光素酶活性。对于腺病毒（CaCN、FLAG-CAIN或βgal/GFP），用107PFU/ml；对于所有其他药物，细胞处理5.5小时。（A）使用10 pM–1 nM CCK对NFAT-luc报告子进行剂量反应激活。（B） 特定钙调神经磷酸酶抑制剂FK506（100 pM–10 nM）和CsA（1 nM–100 nM）对CCK诱导的NFAT-luc活化的剂量反应抑制。（C） 通过过度表达截断形式的内源性钙调神经磷酸酶抑制剂CAIN（Flag-CAIN）抑制CCK-和CaCN诱导的NFAT-luc活化。（D） 用A23187、蛙皮素和卡巴胆碱激活NFAT离化酶的剂量反应。相对荧光素酶活性（RLU）归一化为裂解液中的蛋白质浓度。数据表示3-8个独立腺泡分离的平均±SE，每个制剂的平均计数为4个孔*与经车辆处理的对照组相比，p<0.05或**p<0.01#p<0.05或##与激动剂（100 pM CCK）治疗的对照组相比，p<0.01。
图5。
图5。
内源性CCK分泌的增加促进了体内细胞核NFAT的增加。（A） 适应粉末饮食的小鼠隔夜禁食，并用含有0.1%卡莫司他特的食物喂养0-1.5小时。禁食前，用FK506治疗的动物每天两次注射3毫克/公斤，持续2天。提取核蛋白并进行Western blotting分析。所示斑点代表NFATc1-c3的至少三个独立实验，以及核（层粘连蛋白A/C）负荷控制。（B） 短期使用含有迷走神经抑制剂的饮食不会改变胰腺中NFAT蛋白的总表达。用60μg/lane负载全细胞提取物，并使用NFATc1-c3抗体进行Western blotting分析。图中显示了具有代表性的螺栓以及负载控制（拉明A/C）。
图6。
图6。
内源性CCK升高导致NFAT在体内激活。（A） FVBN雄性NFAT-luciferase小鼠及其非转基因窝鼠被喂食一只对照组或一只含有0.1%卡莫司他特的食物7天。然后处死小鼠，快速切除其肝脏和胰腺并使其均质。使用FK506治疗的动物在使用卡莫司他治疗之前和整个治疗期间每天两次注射3 mg/kg，持续2天。（A） 喂食含有迷走神经抑制剂的食物会增加转基因NFAT-luc小鼠胰腺中NFAT-luc报告酶的表达，但在野生型同窝鼠对照组中没有；在肝脏中，由于卡莫司他治疗，两组的报告基因表达没有差异。（B） 注射FK506完全阻断了卡莫司他诱导的NFAT-luc转基因小鼠胰腺中NFAT-Luce报告基因表达的增加。肝脏表达没有受到影响。n=3-8只动物/组**与对照组比较p<0.01；##与生理盐水注射、卡莫司他氟组相比，p<0.01。
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