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.2008年3月；86(4):937-46.
doi:10.1002/jnr.21540。

乙醇促进内质网应激诱导的神经元死亡：氧化应激的参与

陈刚（音译） 1, 马翠玲, 金伯利·A·鲍尔, 石祥林, 遵纪客, 贾洛
附属公司

乙醇促进内质网应激诱导的神经元死亡：氧化应激的参与

陈刚（音译）等。 神经科学研究杂志. 2008年3月.

摘要

发育过程中乙醇暴露最具破坏性的影响之一是大脑特定区域的神经元丢失。潜在的细胞/分子机制尚不清楚。内质网（ER）参与翻译后蛋白质的加工和转运。内质网腔中未折叠或错误折叠蛋白的积累触发内质网应激，其特征是翻译衰减、内质网伴侣蛋白（如GRP78）的合成以及转录因子（如ATF4、ATF6和CHOP）的激活。持续的内质网应激最终导致细胞死亡。用衣霉素和thapsigargin处理可在实验上诱导内质网应激反应。以SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞和初级小脑颗粒神经元为体外模型，我们证明单独暴露于乙醇对内质网应激标记物的表达几乎没有影响；然而，当被衣霉素和他吡加金诱导时，乙醇显著增强了GRP78、CHOP、ATF4、ATF6和磷酸化PERK和eIF2α的表达。一直以来，乙醇促进了衣霉素和他巴霉素诱导的细胞死亡。乙醇快速引起培养神经元细胞的氧化应激；抗氧化剂阻止了乙醇增强内质网应激和细胞死亡，表明乙醇引起的内质网胁迫反应是由氧化应激介导的。CHOP是一种促凋亡转录因子。我们进一步证明CHOP在乙醇引起的细胞死亡中起着重要作用。因此，乙醇的作用可能由氧化应激和内质网应激之间的相互作用介导。

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数字

图1
图1
乙醇对内质网应激的影响。SH-SY5Y细胞在无血清培养基中培养，并用乙醇（Et；0或400 mg/dl）处理指定时间。收集细胞裂解物，用免疫印迹法检测内质网应激标记物的表达。为了确保装载量相等，剥离印迹并用抗凝集素抗体进行复制。采用衣霉素作为诱导内质网应激的阳性对照。实验重复了三次。
图2
图2
乙醇对膜霉素和他普菌素诱导的内质网应激的影响。答：用乙醇（Et；0或400 mg/dl）和/或不含抗氧化剂NAC（10 mM）预处理SH-SY5Y细胞12小时，然后用衣霉素（Tun；0或3µg/ml）处理指定时间。收集细胞裂解物，用免疫印迹法检测内质网应激标记物的表达。剥离印迹，并用抗凝集素抗体进行复制。B类：除了用thapsigargin（Tha；0或1µM）处理细胞外，标记与A中的标记相同。C：小脑颗粒神经元原代培养物用乙醇（0或400 mg/dl）预处理12小时，然后暴露于衣霉素（Tun；0或3µg/ml）指定时间。如上所述检测ER应激标志物的表达。医生：除了用thapsigargin（Tha；0或1µM）处理细胞外，标记与C中的标记相同。实验重复了三次。
图3
图3
乙醇对衣霉素和他霉素诱导的细胞死亡的影响。答：用乙醇（Et；0或400 mg/dl）和/或不含抗氧化剂（10 mM NAC或5 mM GSH）预处理SH-SY5Y细胞12小时，然后暴露于衣霉素（Tun；0或3µg/ml）48小时。活细胞的数量通过显微镜下计数确定，并表示为未处理对照的百分比。每个数据点（±SEM；bar）是三个实验的平均值。B类：除了用thapsigargin（Tha；0或1µM）处理细胞外，标记与A中的标记相同。C：小脑颗粒神经元的原代培养物用乙醇（0或400 mg/dl）和/或NAC预处理12小时，然后暴露于膜霉素（Tun；0或3µg/ml）48小时。如上所述检查活细胞的数量。医生：除了用thapsigargin（Tha；0或1µM）处理细胞外，标记与C中的标记相同*与Tun-或Tha-治疗组有显著差异。
图4
图4
乙醇对细胞内ROS浓度的影响。答：将SH-SY5Y细胞暴露于乙醇（Et；0或400 mg/dl）中指定的时间，按照材料和方法中的描述通过流式细胞术检测细胞内ROS浓度。每个数据点（±SEM；bar）是三个实验的平均值。B类：将SH-SY5Y细胞暴露于乙醇（0或400 mg/dl）（含/不含NAC（10 mM））中2小时，然后用衣霉素（Tun；0或3µg/ml）处理6小时。用流式细胞仪检测细胞内ROS浓度*与Ct或Tun治疗组相比有显著差异。
图5
图5
乙醇和衣霉素对CHOP缺失小鼠胚胎成纤维细胞（CHOP−/−MEFs）存活的影响。CHOP−/−和CHOP+/+MEF用乙醇（Et；0或400 mg/dl）和/或不加NAC（10 mM）预处理12小时，然后暴露于衣霉素（Tun；0或3µg/ml）48小时。如材料和方法中所述，通过MTT测定细胞活力。活细胞数量表示为未经处理的对照组的百分比。每个数据点（±SEM；bar）是三个实验的平均值*CHOP+/+MEF配对组的显著差异。
图6
图6
CHOP siRNA对乙醇和衣霉素介导的细胞死亡的影响。答：用CHOP siRNA（320和321）或对照siRNA（Ct-siRNA）转染SH-SY5Y细胞24小时。之后，将细胞暴露于膜霉素（Tun；0或3µg/ml）6小时。用免疫印迹检测CHOP的表达。B类：用CHOP siRNA或对照siRNA（Ct-siRNA）转染48小时后，用乙醇（0或400 mg/dl）和/或不加NAC（10 mM）预处理细胞12小时，然后暴露于衣霉素（Tun；0或3µg/ml）48小时。通过显微镜下计数确定细胞数，并以未处理对照的百分比表示。每个数据点（±SEM；bar）是三个实验的平均值*与成对未治疗组或Ct-siRNA治疗组相比有显著差异。
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