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.2007年11月；130(5):465-78.
doi:10.1085/jgp.200709843。 Epub 2007年10月15日。

KcsA门控I的定量描述：宏观电流

苏达查克拉帕尼 1, Julio F Cordero-Morales公司, 爱德华多·佩罗佐
附属公司

KcsA门控I的定量描述：宏观电流

苏达查克拉帕尼等人。 J Gen Physiol杂志. 2007年11月.

摘要

原核K（+）通道KcsA由细胞内质子激活，其门控由跨膜电压调节。通常，KcsA函数是在稳态条件下，使用宏观铷（+）通量实验和单通道电流测量进行研究的。这些研究对KcsA的选通动力学提供了有限的见解，因为其开放概率低，贴片中通道数量的不确定性，以及非常强的内在动力学可变性。在这项工作中，我们通过检查pH值和电压对激活、失活和慢激活门控事件的影响，对非稳态条件下的KcsA门控进行了详细分析。我们发现KcsA的激活和失活门控主要由pH调节，而电压没有显著影响。激活门控显示出乙状pH依赖性，pKa约为4.2，Hill系数约为2。在质子持续存在的情况下，KcsA经历了电导的时间依赖性衰减。这种失活过程与pH无关，但受电压和渗透离子性质的调节。失活的恢复是通过失活实现的，并且似乎与电压有关。我们进一步发现，KcsA中的失活并不完全是开导通道的特性，但也可以从部分“激活”的闭合状态发生。失活过程从这些前开闭状态开始和恢复的时间过程似乎与开态失活不同，这表明存在具有不同动力学路径的多个失活状态。在动力学模型的框架内，对这些信息进行了分析，并对KcsA单通道行为进行了详细研究（在随附的论文中）。综合我们的数据，构成了KcsA门控的第一个定量描述。

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图1。
图1。
pH跳跃实验中KcsA的宏观行为。在凝集素脂质体中重建后，KcsA主要以其C末端在囊泡内定向。在一个由内而外的补丁中，使用快速溶液交换器，通过pH值从8.0跳到3.0来激活KcsA。通道在～15 ms内激活，在质子持续存在的情况下，通道失活，时间常数为1–3 s。
图2。
图2。
KcsA的pH依赖性激活。（A） 通过pH跳跃宏观激活KcsA。选择脉冲的持续时间，以便在电流因失活而开始衰减之前激发最大激活并关闭通道。（B） pH值从8.0跳至指示值时，产生的代表性宏观电流轨迹。在对称200 mM K下记录电流+保持膜电位为+100 mV。（C）激活时间过程的前25 ms的扩展视图。在相对更基本的pH值（4.0–4.5）（D）下，乙状结肠宏观激活的底部（方框区域）很明显。电流达到其最大值一半所需的时间（T0.5)作为pH值的函数进行测量和绘制，并用希尔方程进行拟合。（插图）标准化T图0.5（针对六种不同的贴片进行测量）。活化和n的pKaH（H）分别为4.37±0.03和2.11±0.33。（E） 峰值振幅是开放概率的反映，与希尔方程拟合的pH值相比。（插图）为10个斑块绘制的归一化峰值振幅，pKa（4.22±0.02）和nH（H）(1.9 ± 0.2).
图3。
图3。
电压对KcsA激活的影响。（A） 在去极化（左）和超极化（右）膜电位处pH值从8.0跳至3.0时记录的归一化电流迹线重叠。（B） 半最大激活所需的时间（T0.5)根据三个数据集的电压绘制。负电位下的激活速率略快于正膜电位下的活化速率（约两倍）。（C） 从pH值8.0跳至指示pH值引发E71A的宏观激活。分别在去极化电位和超极化电位下记录黑色和红色痕迹。将电流归一化为其峰值振幅。这一结果表明，去除失活后，正负电位下的活化时间常数没有变化。
图4。
图4。
电压对失活门控的影响。（A） pH值从8.0跳至3.0时，宏观电流被激发，并在不同的膜电位下记录。（B） 通过对宏观衰减阶段拟合一个指数来测量失活的时间常数，并将其绘制为电压的函数。当膜保持在超极化电位时，KcsA失活得更快。（插图）显示三个补丁的标准化时间常数。
图5。
图5。
pH对失活门控的影响。（A） 在200 mM K的存在下，对不同pH值诱发电流+对称的。选择pH脉冲方案的长度，以便在每种情况下，电流衰减到其稳态值。膜电位保持在+100 mV（左）。宏观电流的衰减相位在归一化到峰值振幅后重叠。失活时间常数通过与电流衰减的单指数拟合进行估算，并根据pH值（中间值）绘制。由于贴片之间的失活率存在很大差异，因此每次实验中，在不同pH值下测得的值均归一化为在pH值3.0时测得的数值。图中显示了九个补丁的测量值（右）。在存在（B）5 mM K的情况下记录电流+外部/200 mM K+内部和（C）200 mM Rb+对称的。与对称K相比+当外源K+当Rb+是渗透离子（注意时间尺度上的差异）。归一化时间常数来自5 mM K的八个和三个补丁+外部/200 mM K+内部和200 mM Rb+分别对称。在任何这些条件下，pH值都不会显著影响灭活率。
图6。
图6。
电压和pH值对失活的影响。（A） 失活或通道关闭是由pH值从8.0跳至pH值3.0引起的。选择激活脉冲的持续时间，以激发最大通道激活，并在电流因失活而衰减之前终止。（B） 在+100（黑色）和-100 mV（红色）保持电位下，通过四个pH脉冲测量失活重叠。通道在−100 mV时关闭的速度略慢于+100 mV。（C）E71A在正电位和负电位下的失活动力学相似。（D） 在不同pH脉冲激活后，pH 8.0使通道失活。该图显示了归一化为峰值振幅的电流衰减相位的重叠。宏观通道闭合率与诱发激活的pH值无关。（E） 与pH值8.0相比，pH值5.5导致通道关闭时，失活速度慢得多，且为双指数。
图7。
图7。
从失活中恢复。电流由双pH脉冲方案激发，脉冲间持续时间可变，pH值为8.0，以监测KcsA的恢复时间过程。膜保持在+100 mV（A）或−100 mV（B）。当脉冲间隔增加到500 ms以上时，响应第二个脉冲的电流振幅开始逐渐增加。（C）分数恢复，如（I/I）所测最大值)根据四个斑块绘制出脉冲间隔的函数，并拟合成单个指数。KcsA从失活中的恢复受电压调节，在+100 mV时比在−100 mV时快约三倍。
图8。
图8。
KcsA中的关闭状态失活。（A） 通过测量在正（左）和负（右）膜电位下中等pH值（5.5）预脉冲的不同持续时间对电流的响应，评估通道开放前KcsA从闭合状态的失活。pH值为3.0的侧翼脉冲诱发的电流以黑色显示，而预脉冲的响应以红色显示。峰值电流的振幅随着预脉冲持续时间的增加而逐渐减小。这种减少归因于通道从部分激活的闭合状态失活。（B） 用pH 6.0的预脉冲重复上述方案。在pH 6.0（C）的预脉冲期间，没有可见的通道损失。预脉冲后的峰值电流振幅由第一个和第三个脉冲的峰值电流值I/I标准化最大值绘制为四块贴片预脉冲持续时间的函数。
图9。
图9。
离子渗透对失活的影响。（A） 在对称K下，在−100 mV下，通过pH 3.0的10-s脉冲激活KcsA+（200毫米）。通道迅速打开并最终失活，如红色痕迹所示。黑色轨迹组表示电压脉冲在pH脉冲后延迟施加的条件。在延迟期间，通道完全打开，但由于缺乏电化学驱动力而不导电。在这些条件下，仍然可以看到通道失活，尽管时间过程似乎比伴随离子渗透时慢（红色痕迹）。（B） 有（红色）和无离子渗透（黑色）的灭活时间过程。插图显示了三个补丁的数据。
图10。
图10。
从无离子传导的失活过程中恢复通道。（A） 在+100 mV（左）和−100 mV（右）下，采用脉冲间持续时间（pH 8.0）为5 s的双脉冲方案测量KcsA的部分回收率。（B） 为了测量在没有离子传导的情况下通道从失活状态中的恢复，通道通过跳跃至pH 3.0而打开，但保持在0 mV。随后脉冲间持续时间为5 s。在此间隔期间恢复的通道部分是根据+100 mV时pH 3.0的第二个脉冲的振幅测量的（左）或−100 mV（右）。当通道失活而没有离子传导时，恢复程度更大。（C） 为了评估在0 mV的pH值为3.0的脉冲中是否确实使通道失活，在pH值脉冲结束时将电压更改为+100 mV。电流的振幅与第一个测试脉冲的稳态值的振幅相对应，这清楚地表明大多数通道都被灭活了。
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