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.2007年12月；27(24):8834-47.
doi:10.1128/MCB.00974-07。 Epub 2007年10月15日。

DNA修复酶Ape1的ATF4依赖性氧化诱导抵消亚砷酸盐的细胞毒性并抑制亚砷酸钠介导的突变

华丰 1, 刘平芳, 布鲁斯·丹普尔
附属公司

DNA修复酶Ape1的ATF4依赖性氧化诱导抵消亚砷酸盐的细胞毒性并抑制亚砷酸钠介导的突变

华丰等。 分子细胞生物学. 2007年12月.

摘要

亚砷酸盐是一种人类致癌物质，可导致皮肤、膀胱和肺部肿瘤，但这些影响的细胞机制尚不清楚。我们研究了必需碱基切除DNA修复酶无嘌呤核酸内切酶1（Ape1）在亚砷酸钠作用下的表达。在小鼠10T（1/2）成纤维细胞中，亚砷酸盐诱导的Ape1在mRNA、蛋白质和酶活性水平上几乎相同。对APE1启动子区域的分析显示，AP-1/CREB结合位点对亚砷酸盐诱导小鼠和人类细胞的转录激活至关重要。电泳迁移率变化分析表明ATF4/c-Jun异二聚体是负责的转录因子。靶向c-Jun或ATF4的RNA干扰消除了砷化物诱导的APE1转录。Ape1或ATF4的抑制使小鼠成纤维细胞（10T（1/2））和人淋巴母细胞样细胞（TK6）对亚砷酸盐的细胞毒性敏感。来自转基因的Ape1的表达并不能有效地恢复ATF4耗竭细胞中的亚砷酸盐抗性，但确实抵消了亚砷酸盐治疗后碱性DNA损伤的初始积累。亚砷酸盐（在TK6细胞的TK和HPRT位点）仅在ATF4缺失的细胞中观察到突变，这被转基因的Ape1表达强烈抵消。因此，ATF4介导的Ape1和其他基因的上调对砷化物介导的毒性和诱变起着关键作用。

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数字

图1。
图1。
的表达式mAPE1型响应10T½细胞中的亚砷酸钠。（A） 剂量反应实验。汇合细胞在含有指示浓度亚砷酸盐的培养基中处理30分钟，然后清洗并在新鲜培养基中培养2小时，然后采集用于Northern印迹分析。（B） 动力学。汇合细胞用50μM亚砷酸盐处理指定时间，然后清洗，在新鲜培养基中培养2小时，然后采集用于Northern印迹分析。（C和D）分别在与面板A和B所示实验相对应的条件下的细胞存活率。（E） 亚砷酸盐治疗4小时后，用免疫印迹法检测Ape1蛋白水平。（F） 亚砷酸盐处理6小时后，进行Ape1活性的AP核酸内切酶分析。35-mer带是底物，12-mer带是AP内切酶裂解产物。AP，纯化hApe1作为阳性对照。进行了三组独立的分析，并将其归一化为用于Northern印迹的GAPDH mRNA或用于免疫印迹的β-actin。标准偏差用误差线表示。显著不同的值(P（P）<0.05）。
图2。
图2。
mAPE1型启动子活性对亚砷酸盐暴露的反应。将10T½细胞置于60-mm的培养皿中，转染含有2μgmAPE1型发起人-CAT公司报告者（小鼠启动子区的1.8kbmAPE1型基因融合到CAT公司报告基因）和2μg pCMV-β-gal作为对照。36小时后，将汇合的细胞用指定浓度的亚砷酸钠处理30分钟（A）或用50μM亚砷酸钠处理指定时间（B）。亚砷酸盐处理后，更换培养基，并在收获前将细胞再孵育6小时，以测定CAT和β-半乳糖苷酶活性。（C） 亚砷酸盐活化hAPE1型发起人。按照上述面板A和B的程序，用含有1.9-kb片段的pCB9转染10T½细胞hAPE1型启动子（17、24、25）和亚砷酸钠处理。从每个实验测量值中减去背景CAT活性（来自模拟转染细胞），并通过与背景提取的β-半乳糖苷酶活性归一化来校正转染效率的变化。在不存在亚砷酸盐的情况下，pCAT-Basic的归一化CAT活性被任意分配为1的值，并且每个数据点表示来自三个独立实验的平均值加标准偏差（误差条）。显著不同的值(P（P）<0.05）。使用的CAT报告器显示在每个面板的顶部。
图3。
图3。
的标识mAPE1型启动子区负责亚砷酸盐介导的基因诱导。（A）mAPE1型promoter-CAT构造。质粒pCBM包含大约1.8 kb的小鼠启动子区域mAPE1型该基因与CAT报告基因融合。图中显示了由启动子起始位点（pCBM1、pCBM6、pCBM20、pCBM18和pCBM2）连续5′缺失产生的pCBM14衍生物。用0、10和50μM亚砷酸钠处理细胞30分钟。启动子报告分析如图2图例所示。改变(n个-fold）表示为平均值，误差条对应于标准偏差。显著不同的值(P（P）<0.05）。Con，控制。（B） 共有转录因子结合位点mAPE1型启动子区（−309至−186bp）。CREBP1，环腺苷酸反应元件结合蛋白1。（C） 映射的123-bp片段的示意图。实验确定或推测的转录因子结合位点显示在该行上：AP-1/CREB、激活蛋白1/cAMP反应元件结合蛋白（圆圈）；GR-3，早期生长反应3（三角形）；NF-1，核因子1（平方）。改变DNA序列以产生以灰色显示的八个突变启动子。突变的启动子位于mAPE1型-CAT报告载体（表1）。突变的结合位点用mA（突变的AP-1/CREB位点）、mG（突变的GR3位点）和mN（突变的NF-1位点）表示，而野生型结合位点用A（AP-1/CRE位点）、G（GR3位点”和N（NF-1位点”表示。
图4。
图4。
使用EMSA鉴定亚砷酸盐激活的DNA结合活性。（A） 亚砷酸盐处理10T½细胞激活123-bp的体外蛋白结合APE1接口启动子片段。将细胞在无亚砷酸盐或指示亚砷酸钠浓度下处理30分钟，然后清洗细胞并在新鲜培养基中培养所示时间。细胞提取物的制备和EMSA反应按照材料和方法中的描述进行。（B） 与过量（5到100倍）浓度的未标记野生型DNA序列竞争（w）。图中显示了亚砷酸钠或冷竞争物的存在（+）或不存在（-）。（C） 与含有改变的因子结合位点的寡核苷酸竞争。竞争性寡核苷酸以50倍（仅野生型[w]）或100倍摩尔过量使用。电泳后，对凝胶进行16小时（D）竞争性寡核苷酸序列的自动射线照相。更改后的站点带有下划线。（E） EMSA仅通过ATF4或c-Jun抗体超移。在EMSA反应中使用10T½细胞制备的提取物，这些提取物在加入或不加入50μM亚砷酸钠的情况下处理30分钟。使用兔免疫球蛋白G对照物（Con-Ig）或针对指示转录因子的抗体进行超移分析，如材料和方法所述。对凝胶进行16至48小时的自动放射自显影。仅显示了自动放射自显影图的顶部。控制（a）和亚砷酸盐处理电池（b）显示了单独的面板。
图5：。
图5：。
ATF4缺陷或c-Jun缺陷的10T½细胞在砷化物诱导下有缺陷mAPE1型启动子激活。（A和B）通过siRNA下调c-Jun（A）和ATF4（B）蛋白（分别由S-Jun和S-ATF4指示，以S-LUC作为对照）。用产生指示的siRNA的逆转录病毒感染细胞，并扩增嘌呤霉素抗性细胞（S-ATF4为7或8天，S-JUN为10至12天）用于治疗和分析。生成无细胞裂解物，用于通过免疫印迹进行蛋白质分析。Con，不进行siRNA处理的对照。（C） 有缺陷的mAPE1型c-Jun缺陷细胞或ATF4缺陷细胞对亚砷酸钠的反应。如图A和图B所示，在抑制c-Jun或ATF4表达的处理后，用指示浓度的亚砷酸钠处理细胞30分钟，然后在采集和分析之前在无砷培养基中培养6小时。如图2图例所述进行CAT报告基因测定。所示数据基于至少三个独立实验。标准偏差用误差线表示。显著不同的值(P（P）<0.0）。条形图下方的名称表示siRNA和亚砷酸盐处理（例如，L-0对应于LUC siRNA，无亚砷酸，J-50对应于c-JUN siRNA和50μM亚砷酸钠处理，A-0对应于ATF4 siRNA，不含亚砷酸）。
图6。
图6。
亚砷酸盐活化mAPE1型启动子通过氧化机制。用新鲜制备的5或20 mM预处理在10 cm培养皿中培养的汇合10T½细胞N个-乙酰基-我-半胱氨酸（NAC）培养1小时。在初始培养后，添加50至75μM亚砷酸钠，并持续培养30分钟。将细胞清洗两次，在新鲜培养基中培养6小时，然后收集用于CAT分析。顶部面板显示了一组CAT分析的代表性放射自显影图；运行了三个独立的实验来生成下面板中显示的量化数据。标准偏差用误差线表示。显著不同的值(P（P）<0.05）。
图7。
图7。
ATF4缺乏细胞中Ape1水平的变化。感染表达抗ATF4（S-ATF4）siRNA的逆转录病毒或mApe1逆转录病毒表达载体的细胞在适当的选择条件下进行培养以汇合（对于siRNA载体为嘌呤霉素，对于mApe2表达载体为潮霉素）。然后用20至50μM亚砷酸钠处理细胞30分钟。将细胞清洗两次，在新鲜培养基中继续培养4小时。通过免疫印迹和磷光成像测定Ape1蛋白水平，并将其归一化为β-肌动蛋白信号。（A） 10T½电池。（B） TK6细胞。每一帧的顶部面板显示了一个具有代表性的免疫印迹，图中显示了三个独立实验的定量。标准偏差用误差线表示。显著不同的值(P（P）<0.05）。
图8。
图8。
砷诱导ATF4缺乏细胞的凋亡和细胞毒性。单元格（107)用siRNA预感染LUC（对照[Con]），mAPE1型（S-mAPE1），hAPE1型用指示浓度的亚砷酸钠对（S-hAPE1）、ATF4（S-ATF4）或hAPE1或mApe1逆转录病毒表达载体（分别为hApe2和mApe2）进行30分钟的攻击。将细胞清洗两次，并在新鲜培养基中继续培养4小时。然后将10T½（A）或TK6（B）细胞重新接种到96个平板（10个）中三细胞计数试剂盒8测定细胞数。结果通过10T½细胞的平行传统克隆形成试验或TK6细胞的台盼蓝排除试验得到证实（数据未显示）。（C） 利用流式细胞术通过膜联蛋白V-FITC-碘化丙啶测定测定细胞凋亡。砷化细胞在新鲜培养基中培养24小时，然后取样进行凋亡检测。数据是从三个独立的实验中量化的。标准偏差用误差线表示。显著不同的值(P（P）<0.0）。
图9：。
图9：。
ATF4缺乏细胞中的碱性DNA损伤和凋亡。将预先感染表达抗荧光素酶siRNA（sLUC）或ATF4（sATF4）载体或sATF4+mApe1逆转录病毒表达载体（sATV4+mApe1）的10T½细胞培养成融合细胞。然后用50μM亚砷酸钠处理细胞30分钟。将细胞清洗两次，并在新鲜培养基中培养指定时间。对细胞进行DNA提取，以使用醛类反应探针分析（A）确定碱性损伤，或收集细胞，通过膜联蛋白V-FITC-碘化丙啶染色和流式细胞术（B）确定凋亡。数据是从三个独立的实验中量化的。标准偏差用误差线表示。显著不同的值(P（P）sLUC控制值的<0.05）用星号表示。
图10。
图10。
砷化物诱导的TK公司和高效放射治疗ATF4缺乏的TK6细胞中的基因。用图9图例中所述的载体感染TK6细胞，并按指示剂量用亚砷酸钠处理30分钟。然后更换培养基，并按照材料和方法中所述对细胞进行突变分析。（A）TK公司突变与亚砷酸盐剂量的关系。TFT（变速器油液温度）R（右），抗三氟吡啶；Con，对照，S-ATF4，来自表达抗ATF4 siRNA的细胞的siRNA。（B）TK公司μM亚砷酸盐激发后的突变，无论是否重新表达mApe1。甲基甲烷磺酸盐（MMS）处理（24小时）作为不涉及APE1接口诱导或氧化机制。（C） ATF4和mApe1在亚砷酸盐诱导中的作用高效放射治疗突变。6TG型R（右），6-硫鸟嘌呤抗性。数据是从三个独立的实验中量化的。标准偏差用误差线表示。显著不同的值(P（P）<0.05）。
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