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.2007年10月31日；26(21):4576-87.
doi:10.1038/sj.emboj.7601860。 Epub 2007年10月4日。

PICK1的聚集和突触靶向需要PDZ结构域和脂质膜之间的直接相互作用

Lifeng锅 1, 郝武, 重审, 亚威石, 金文英（Wenying Jin）, Jun Xia先生, 张明杰
附属公司

PICK1的聚集和突触靶向需要PDZ结构域和脂质膜之间的直接相互作用

Lifeng锅等。 欧洲工商管理硕士J. .

勘误表in

  • EMBO J.2009年2月4日；28(3):307

摘要

与c激酶1（PICK1）相互作用的蛋白质调节受体和离子通道（如AMPA受体）的运输。传统上，PICK1-PDZ结构域被认为是一种能够与PICK1转运的受体结合的适配器，而脂质结合BAR结构域的功能是将PICK1直接连接到膜上。在这里，我们表明PICK1-PDZ结构域可以直接与脂质膜相互作用。PDZ结构域和脂质膜的相互作用由一个多基氨基酸簇和一个远离肽配体结合沟的保守“Cys-Pro-Cys”基序介导。PDZ的破坏和脂质膜的相互作用完全取消了PICK1的突触靶向性。尽管CPC基序的突变不会影响PICK1和AMPA受体之间的相互作用，但突变的PICK1不能聚集受体的GluR2亚基。在神经元中，含有相同突变的PICK1在AMPA受体的运输中表现出明显的能力受损。综上所述，我们的发现不仅揭示了PICK1-PDZ结构域的新型脂质膜结合特性，还提供了直接证据支持PDZ-脂质相互作用的功能相关性。

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数字

图1
图1
PICK1–GluR2尾肽复合物的结构。(A类)立体图显示PICK1 PDZ–GluR2肽复合物的20个重叠NMR结构的主干。使用PICK1 PDZ的残基18–40和47–103（包括GluR2肽的最后五个残基）将结构与平均结构叠加。GluR2肽以红色绘制(B类)PICK1 PDZ–GluR2肽复合物的典型NMR结构的带状图。GluR2肽显示为红色。二级结构按照典型PDZ结构域的方案标记。装箱区域代表PDZ结构域的GluR2肽结合槽，在显式原子模型中绘制了GluR2肽类与PDZ结构区之间的详细相互作用。(C类)表面结构PICK1 PDZ与GRIP1 PDZ5的比较（PDB代码1P1D）。在本演示文稿中，疏水性氨基酸残基以黄色绘制，带正电残基以蓝色绘制，带负电残基则以红色绘制，未带正电的极性残基以灰色绘制。PICK1 PDZ–GluR2复合物中的GluR2肽如蠕虫模型所示。
图2
图2
PICK1的PDZ结构域与磷脂酰肌醇脂质膜结合。(A类)沉淀法测定PICK1-PDZ结构域与牛脑脂提取物制备的脂质体的结合。用“S”和“P”标记的级分表示离心后上清液和颗粒中存在的蛋白质。在本试验中，来自大鼠PLCδ的特征良好的PH结构域作为阳性脂质结合物，来自小鼠Mals2的不相关PDZ结构域作为阴性对照。(B类)PICK1 PDZ与牛脑脂质体的剂量依赖性相互作用（每次反应中脂质体浓缩物的浓度在0至200μg/ml之间变化）。通过拟合剂量依赖性结合曲线，得出PICK1-PDZ与牛脑脂质体的表观结合亲和力(K（K）d日～3.6±0.5μg/ml）。(C类)PICK1 PDZ和Par-3 PDZ2结构域的脂质条带结合分析。数据还表明，Par-3 PDZ2结构域比PICK1 PDZ具有更高的PIP-结合亲和力。(D类)PICK1-PDZ与各种PIP的相互作用，这些PIP被重组为特定的PC/PS脂质体。数值为三个不同实验的平均值±标准差。注意，PIPs的浓度保持在10%，以模拟在质膜中发现的总PIP浓度。
图3
图3
PICK1-PDZ与脂质膜相互作用的表征。(A类)不同物种PICK1 PDZ的基于结构的序列比对。保守的疏水残基以黄色显示，带正电的残基以蓝色显示，其余高度保守的残基则以粉红色显示。形成对βE和αB之间的膜相互作用重要的正电荷簇的残基用红色三角形突出显示。αB1位置的赖氨酸残基用一颗红星突出显示。绝对保守的CPC图案用红色框起，底部以菱形进一步突出。(B类)PICK1 PDZ的表面电荷表示。在该图中，正电荷电位用蓝色表示，负电荷电位用红色表示。标记了Arg76、Lys79和Lys81的位置。(C类)PICK1 PDZ的组合表面和带状图表示说明了正电荷簇的位置和CPC基序的方向。(D类)通过基于沉积的脂质结合分析，分析带正电残基（Lys79和81）和CPC基序（Cys44和46）在脂质膜结合中的作用。标有“S”和“P”的通道代表离心后上清液和颗粒中存在的蛋白质。(E类)碘乙酸修饰PICK1-PDZ的离心脂质膜结合分析。(F类)基于Ellman分析的野生型PICK1-PDZ及其各种Cys到Gly取代突变体中巯基的溶剂可及性测量。在不添加脂质体的情况下，将吸收值归一化为野生型PICK1-PDZ的值。数据表示三个不同实验的平均值±标准差。星号表示指示条之间的显著差异(**P（P）<0.01).
图4
图4
PDZ结构域介导的脂质膜结合调节PICK1的亚细胞定位。(A类)WT PICK1在细胞中形成簇，但PICK1突变体没有形成簇。比例尺=10μm。(B类)通过计算至少有一个簇的细胞数除以转染细胞总数来计算簇细胞的百分比。结果是三个独立实验的平均值。每个实验中至少有2000个细胞被定量。误差条代表标准误差(C类)PICK1和PICK1 CC-GG的亚细胞分级。裂解用GFP-PICK1或GFP-PICK1 CC-GG转染的HEK293T细胞。为这两种蛋白质制备总“T”、细胞溶质“C”和膜“M”组分。通过SDS-PAGE分析等量的蛋白质，并使用抗GFP抗体或抗β-微管蛋白抗体通过蛋白质印迹检测。(D类)量化PICK1和PICK1 CC-GG的细胞溶质/总比率。与WT PICK1（占总PICK1的22.38%±4.1）相比，细胞溶质部分中PICK1 CC-GG的含量显著增加（33.54±3.9%）。N个=4,*P（P）<0.05. (E类)WT PICK1和PLCδPH-PICK1在细胞中形成一些簇，而Par-3 PDZ2-PICK1形成许多簇。比例尺=10μm。(F类)定量结果表明，转染PLCδPH-PICK1的组与野生型PICK1的组之间具有PICK1簇的细胞数量相似(n个=3P（P）>0.05). 与野生型PICK1相比，Par-3 PDZ2-PICK1在转染细胞中形成的簇百分比明显更高(n个=3,**P（P）<0.01).
图5
图5
PICK1 CC-GG突变体具有最小的突触靶向能力。(A类)野生型PICK1在突触处高度聚集，而不是PICK1 CC-GG突变体。比例尺=10μm。(B类)定量结果表明，PICK1 CC-GG突变体的树突密度和PICK1突触簇强度均显著降低。(n个=30,***P（P）<0.001). 为了证实PICK1 CC-GG的转移不会影响神经元的突触形成，海马神经元被GFP-PICK1感染(C类)、GFP-PICK1 CC-GG(D类)、GFP-PICK1 KD-AA(E类)，GFP-PICK1 2KE(F类)仅GFP(G公司)并用抗PSD-95抗体染色。野生型PICK1高度聚集，与PSD-95井共定位。与野生型PICK1相比，GFP-PICK1 KD-AA和2KE突变体形成的簇更少。与野生型PICK1、KD-AA和2KE突变体相比，PSD-95簇中缺少PICK1 CC-GG和GFP。比例尺=10μm。(H（H）)量化结果表明，PICK1 CC-GG形成的簇数明显少于PICK1 KD-AA(n个=10,*P（P）<0.05）和2KE突变体(n个=10,***P（P）<0.001），但PICK1 CC-GG和GFP载体之间没有差异(n个=10,P（P）>0.05). 在PICK1 CC-GG、KD-AA和2KE突变体中，PICK1突触簇的强度也显著降低(n个=10,**P（P）<0.01）。(我)GFP-PICK CC-GG没有显著改变PSD-95簇的数量或强度(n个=10,P（P）>0.05).
图6
图6
PICK1介导的GluR2聚集需要PICK1的PDZ结构域的脂质结合。野生型PICK1和GluR2在细胞中形成共簇(A类)，但PICK1 CC-GG突变体没有与GluR2形成任何簇(B类). PLCδPH-PICK1(C类)和第3段PDZ2-PICK1(D类)形成了许多自簇，但没有一个簇包含GluR2。比例尺=10μm。
图7
图7
PICK1的PDZ结构域的脂质结合对于AMPA受体的突触靶向至关重要。(A类)GluR2/3簇与PICK1簇在突触处共定位。与感染PICK1 CC-GG突变体的神经元相比，感染野生型PICK1的神经元具有更多的GluR2/3突触簇。(B类)通过多次实验量化了GluR2/3簇的强度和密度。GFP-PICK1感染的神经元中GluR2簇的数量显著高于GFP-PICK1 CC-GG突变感染的神经元(n个=13,***P（P）<0.001). (C类)与PICK1 CC-GG突变感染的神经元相比，野生型PICK1感染的神经元具有更多的GluR1簇。比例尺=10μm。(D类)量化结果表明，野生型PICK1感染神经元中GluR1簇的密度显著高于PICK1 CC-GG突变感染神经元(n个=12,***P（P）<0.001).
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