Maternal disturbance in activated sphingolipid metabolism causes pregnancy loss in mice

doi:10.1172/JCI30674

.2007年10月；117(10):2993-3006.

doi:10.1172/JCI30674。

母亲激活鞘脂代谢障碍导致小鼠妊娠损失

Kiyomi Mizugishi（水井清美）¹, 李翠玲, 安娜·奥利维拉, 杰克·比拉夫斯基, Alicja Bielawska公司, Chu Xia Deng先生, 理查德·普罗亚

附属公司

PMID： 17885683
预防性维修识别码：项目经理1978422
内政部： 10.1172/JCI30674号文件

母亲激活鞘脂代谢障碍导致小鼠妊娠损失

Kiyomi Mizugishi（水井清美）等人。临床研究杂志. 2007年10月.

.2007年10月；117(10):2993-3006.

doi:10.1172/JCI30674。

作者

Kiyomi Mizugishi（水井清美）¹, 李翠玲, 安娜·奥利维拉, 杰克·比拉夫斯基, Alicja Bielawska公司, Chu Xia Deng先生, 理查德·普罗亚

附属

¹美国马里兰州贝塞斯达NIH国立关节炎、肌肉骨骼和皮肤病研究所NIDDK发育与疾病遗传学分所。

PMID： 17885683
预防性维修识别码：项目经理1978422
内政部： 10.1172/JCI30674号文件

摘要

子宫蜕膜化是胚胎着床的反应过程，对胚胎存活至关重要，因此是妊娠成功的关键事件。我们发现，妊娠期间蜕膜中鞘磷脂代谢途径被高度激活，鞘氨醇激酶（Sphk）基因的破坏导致蜕膜化缺陷，子宫血管严重受损，导致早孕损失。缺乏Sphk的雌性小鼠（Sphk1（-/-）Sphk2（+/-））在妊娠子宫内表现出二氢鞘氨醇和鞘氨醇的大量积累，以及磷脂酰乙醇胺水平的降低。这些小鼠还表现出蜕膜细胞死亡增加，未分化基质细胞增殖减少，蜕膜血管大量断裂，导致子宫出血和早期胚胎死亡。因此，鞘脂代谢调节适当的子宫蜕膜化和血管稳定性。我们的研究结果还表明，鞘脂代谢紊乱可能被认为是人类妊娠损失的一个原因。

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数字

**图1。卵巢功能正常与植入*Sphk1公司*^–/–*Sphk2公司*^+/–雌性小鼠。**
(A类)卵巢H&E染色的代表性照片(n个= 3). (B类)血清P₄第6.5天、第7.5天、第8.5天和第11.5天的水平(n个= 3). (C–E类)卵巢切除野生型女性Sphk活性的测量。给小鼠注射一次E₂（100纳克/小鼠），单次注射P₄（2毫克/只小鼠）或E₂加P₄6小时或12小时后牺牲(C和D类). 另一组小鼠接受了一种旨在模拟P₄和E₂方法中描述的发情周期和早孕期间的水平(E类). 在Triton X-100在场的情况下进行分析(C和E类)或不含Triton X-100的BSA复合物(D类和E类). 数据表示平均值±SE(n个= 3, **P（P）*<0.01，配对学生t吨测试）。(F类)第1.5天排卵和受精率。排卵结果为平均值±SE。n个＝4（野生型），n个= 3 (*Sphk1公司*^–/–*Sphk2公司*^+/–)，未成对学生的t吨测试。(**G公司**)第5.5天子宫着床部位的代表性照片（蓝色条纹）。箭头表示着床部位。(**H（H）**)在第5.5天用蓝色染料法检查植入部位的数量和重量。数据表示平均值±SE。n个=3（野生型）；n个= 5 (*Sphk1公司*^–/–*Sphk2公司*^+/–); 未成对学生的t吨测试。比例尺：200μm(A类); 1毫米(**G公司**).

**图2。子宫功能缺陷导致早孕*Sphk1公司*^–/–*Sphk2公司*^+/–雌性小鼠。**
(A类–**P（P）**)整个子宫（包括胚胎）和第6.5天胚胎的照片(A类–D类)，第7.5天(E类–**H（H）**)，第8.5天(我–**L（左）**)，第9.5天个人电脑(**M（M）**和N个)和第10.5天(**O（运行）**和**P（P）**). (A类,E类,我,**M（M）**、和**O（运行）**)野生型雌性小鼠的整个子宫。(B类,F类,J,N个、和**P（P）**)整个子宫*Sphk1公司*^–/–*Sphk2公司*^+/–雌性小鼠。(C,**G公司**、和**K（K）**)野生型雌性小鼠子宫中的胚胎。(D类,**H（H）**、和**L（左）**)来自子宫的胚胎*Sphk1公司*^–/–*Sphk2公司*^+/–雌性小鼠。比例尺：200μm(C,D类,**G公司**,**H（H）**,**K（K）**、和**L（左）**); 1毫米(A类,B类,E类,F类,我,J、和**M（M）**–**P（P）**). (问)从第7.5天开始的胚胎表型总结（野生型，n个= 256;*Sphk1公司*^–/–*Sphk2公司*^+/+,n个= 101;*Sphk1公司*^+/+*Sphk2公司*^–/–,n个= 69; 和*Sphk1公司*^–/–*Sphk2公司*^+/–,n个=243），第8.5天（野生型，n个= 40;*Sphk1公司*^–/–*Sphk2公司*^+/–,n个=86），第9.5天（野生型，n个= 7;*Sphk1公司*^–/–*Sphk2公司*^+/–,n个=49）子宫。根据以下分类对胚胎进行计数：正常、发育迟缓（长轴长度：<1.0 mm，第7.5天；<2.0 mm，第8.5天；<2.5 mm，第9.5天）或吸收，并计算百分比以纳入图中。

**图3。蜕膜化缺陷*鞘氨醇1*^–/–*Sphk2公司*^+/–子宫。**
(A类–**K（K）**)野生型和*Sphk1公司*^–/–*Sphk2公司*^+/–第5.5天子宫(A类和B类)，第6.5天(C–F类)和第7.5天个人电脑(**G公司**–**K（K）**). (A类,C,**G公司**、和**H（H）**)野生型子宫(B类,D类–F类、和我–**K（K）**)*Sphk1公司*^–/–*Sphk2公司*^+/–子宫。箭头D类,F类、和我–**K（K）**表示出血，箭头在E类和**K（K）**表明中性粒细胞在蜕膜浸润*Sphk1公司*^–/–*Sphk2公司*^+/–子宫(**L（左）**)第7.5天用抗中性粒细胞抗体进行免疫染色*Sphk1公司*^–/–*Sphk2公司*^+/–子宫。箭头表示中性粒细胞阳性。De，蜕膜；Em，胚胎；He，出血；Np，中性粒细胞；氖；坏死的胚胎。(**M（M）**和N个)原位杂交*Sphk1公司*在野生型子宫中使用反义(**M（M）**)或感觉(N个)探针。箭头在**M（M）**表明*鞘氨醇1*表达式。比例尺：100μm(A类–D类,**G公司**–J、和**L（左）**); 50微米(E类,F类、和**K（K）**); 和1毫米(**M（M）**和N个). 在所有实验中，检查了3只以上的动物。(**O（运行）**)人工蜕膜化。野生型或*Sphk1公司*^–/–*Sphk2公司*^+/–假孕第3.5pc天给小鼠腹腔内输注油。在第7.5天，对子宫进行称重。折叠增加表示注入子宫角和未融合子宫角之间重量的比较。条形图上方的数字表示响应的老鼠数量/老鼠总数。结果表示为平均值±SE**P（P）<*0.01，未成对学生t吨测试。

**图4。细胞有丝分裂减少和细胞死亡增加*鞘氨醇1^–/–斯芬克2型^+/–*蜕膜。**
(A类–**H（H）**)野生型抗磷甾酮H3免疫染色(A类,B类,E类、和F类)和*Sphk1公司*^–/–*Sphk2公司*^+/–(C,D类,**G公司**、和**H（H）**)第5.5天子宫(A类–D类)第6.5天(E类–**H（H）**). (我)磷甾酮H3阳性细胞的百分比。*n个=*6对配对**P（P）<*0.05; ***P（P）<*0.01，配对学生t吨测试。(J和**K（K）**)野生型TUNEL分析(J)和*Sphk1公司*^–/–*Sphk2公司*^+/–(**K（K）**)第5.5天子宫内有箭头**K（K）**表明细胞死亡增加*Sphk1公司*^–/–*Sphk2公司*^+/–子宫(**L（左）**–**O（运行）**)野生型TUNEL分析(**L（左）**和**M（M）**)和*Sphk1公司*^–/–*Sphk2公司*^+/–(N个和**O（运行）**)第7.5天子宫。**M（M）**和**O（运行）**在**L（左）**和N个分别为。箭头在N个表明细胞死亡增加*Sphk1公司*^–/–*Sphk2公司*^+/–蜕膜。(**P（P）**和问)第7.5天用抗细胞角蛋白免疫染色标记滋养层细胞*Sphk1公司*^–/–*Sphk2公司*^+/–子宫。问代表了在**P（P）**.箭头在**P（P）**对应于中的N个注意箭头所示区域无阳性染色。箭头表示滋养层细胞呈阳性。(**R（右）**和**S公司**)在第7.5天用抗结蛋白免疫染色标记蜕膜细胞*鞘氨醇1*^–/–*Sphk2公司*^+/–子宫。**S公司**显示了中框状区域的高倍视图**R（右）**.箭头在**R（右）**对应于中的N个注意，图中箭头和星号分别表示蜕膜细胞萎缩和正常蜕膜细胞**S公司**.比例尺：100μm(A类–**H（H）**和**L（左）**–**S公司**); 50微米(J和**K（K）**). 在所有实验中，检查了3只以上的动物。

图5。野生型蜕膜细胞和蜕膜血管的透射电镜分析(A类–C),*Sphk1公司*^–/–*Sphk2公司*^+/–(D类–我)，以及*Sphk1公司*^–/–*Sphk2公司*^+/+(J–**L（左）**)子宫。
aEC，异常内皮细胞，胞质轻而粗糙；bEC，内皮细胞破裂；BL，基膜；CB；多层膜质胞体；DC，蜕膜细胞；EC，内皮细胞；EJ，内皮细胞-细胞连接；红细胞，红细胞；白细胞，白细胞。箭头在D类–F类和**K（K）**表明内皮细胞断裂。箭头在**H（H）**,我、和**L（左）**显示多层膜质细胞质体。原始放大倍数，×2000(A类,C,D类,**G公司**,**H（H）**、和**K（K）**); ×16,000 (B类,F类、和我); ×6,300 (E类和**L（左）**); 和×3150(J).

**图6。*维格夫*,*Angpt1型*,*Angpt2型*、和*第2级*mRNA表达。**
*维格夫*(A类),*Angpt1型*(B类),*Angpt2型*(C)，以及*第2级*(D类)野生型和野生型蜕膜组织中6.5天和7.5天蜕膜组织mRNA的表达*Sphk1公司*^–/–*Sphk2公司*^+/–通过实时PCR确定雌性。表达水平与野生型蜕膜中的表达水平相关。数据表示平均值±SE。n个= 3.

**图7。Sphk活性测量。**
在非妊娠全子宫、7.5天蜕膜和7.5天植入野生型、，*鞘氨醇1*^–/–*斯芬克2型*^+/+,*Sphk1公司*^+/+*Sphk2公司^–/–*、和*Sphk1公司*^–/–*Sphk2公司*^+/–女性。在Triton X-100在场的情况下进行分析(A类和B类)或不含Triton X-100的BSA复合物(C和D类). (A类和C)TLC分析[³²P] Sphk在子宫样本中形成S1P。显示了S1P和原点的带。(B类和D类)Sphk活动。数据代表平均值±SE，并在7.5天蜕膜组织和7.5天植入组织之间进行比较。n个= 3. **P（P）*<0.05，配对学生t吨测试。

**图8。鞘磷脂和相关甘油磷脂生物合成途径。**
酶的表达水平在怀孕期间增加，用红色表示。十、基因破坏*Sphk公司*基因。

**图9。妊娠期鞘脂代谢相关酶的表达水平。**
相对mRNA表达*Sphk1公司*,*Sphk2公司*,*Sptlc1型*,*Sptlc2型*,*第1阶段*,*第1阶段*,*Smpd1、Smpd2、Smpd3、Asah1、，* *Asah2、Lass1、Lass2、Las4、Lass5、Lass6、，*和*摄氏度1*在未怀孕的整个子宫中，妊娠小鼠蜕膜7.5天，野生型和*Sphk1公司*^–/–*Sphk2公司*^+/–通过实时PCR确定雌性。表达水平显示为相对于非妊娠野生型子宫的表达水平。数据表示平均值±SE，并在蜕膜7.5天和植入间7.5天组织之间进行比较。n个= 3. **P（P）*< 0.05; ***P（P）*<0.01，配对学生t吨测试。

**图10。鞘脂水平的测量。**
二氢S1P(A类)、S1P(B类)，二氢鞘氨醇(C)，鞘氨醇(D类)，神经酰胺(E类)和鞘磷脂(F类)在未怀孕的全子宫（野生型和*Sphk1公司*^–/–*Sphk2公司*^+/–)第7.5天蜕膜（野生型，*Sphk1公司*^–/–*Sphk2公司*^+/+,*Sphk1公司*^+/+*Sphk2公司*^–/–、和*Sphk1公司*^–/–*Sphk2公司*^+/–)通过质谱分析。数据表示平均值±SE。n个= 3. **P（P）*< 0.05; ***P（P）*<0.01，配对学生t吨测试。

**图11。甘油磷脂水平的测量。**
CL公司(A类)，个人电脑(B类)、PE(C)、和PS(D类)测定野生型和非妊娠全子宫和7.5天蜕膜中的水平*Sphk1公司*^–/–*Sphk2公司*^+/–怀孕的雌性小鼠。数据表示平均值±SE。n个= 3. ***P（P）*< 0.05, **P（P）*=0.05，配对学生t吨测试。

**图12。*第2部分*mRNA表达与PGE₂水平。**
(A类)*第2部分*野生型和野生型蜕膜组织中6.5天和7.5天蜕膜组织mRNA的表达*Sphk1公司*^–/–*Sphk2公司*^+/–通过实时PCR确定雌性。表达水平与野生型蜕膜中的表达水平相关。(B类)前列腺素E₂野生型和*Sphk1公司*^–/–*Sphk2公司*^+/–怀孕的雌性小鼠。数据表示平均值±SE。n个= 3.

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1. Olivera A.、Spiegel S.鞘氨醇-1-磷酸作为PDGF和FCS有丝分裂原诱导细胞增殖的第二信使。自然。1993;365:557–560.-公共医学

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