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.2007年12月；81(23):12899-910.
doi:10.1128/JVI.01280-07。 Epub 2007年9月19日。

肉豆蔻酰化是人类免疫缺陷病毒1型Gag-Gag在哺乳动物细胞中多重聚合所必需的

华立 1, 杜军（Jun Dou）, 丁玲梅, 保罗·斯皮尔曼
附属公司

肉豆蔻酰化是人类免疫缺陷病毒1型Gag-Gag在哺乳动物细胞中多重聚合所必需的

华立等人。 J维罗尔. 2007年12月.

摘要

人类免疫缺陷病毒1型的Gag蛋白指导病毒粒子的组装过程。在球形未成熟病毒外壳的形成过程中，Gag蛋白必须发生广泛的多重聚合。在体外，缺乏N-末端肉豆蔻酸修饰或核衣壳蛋白（NC）的Gag蛋白可以生成病毒样颗粒。然而，在哺乳动物细胞中存在的条件下，Gag-Gag多重聚合的精确要求尚未完全阐明。在本研究中，采用测量荧光共振能量转移的Gag-Gag多聚化测定法来定义对均聚化至关重要的Gag结构域。共鉴定出三个基本成分：衣壳蛋白（CA）N端和C端结构域中残基的蛋白质相互作用、NC中的基本残基以及肉豆蔻酸的存在。使用v-src中的异源肉豆蔻酰化序列再现了肉豆蔻酸的多重聚合需求。只有当亮氨酸拉链二聚化基序位于NC的位置时，才有一种非糖苷化的Gag蛋白能够多重聚合。这些结果支持Gag-Gag多重聚合的三组分模型，包括Gag的肉豆蔻酰化N末端介导的膜相互作用、CA结构域之间的蛋白-蛋白质相互作用和NC-RNA相互作用。

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图1。
图1。
本研究中描述的Gag-CFP和Gag-YFP结构的示意图。左侧是与图顶部全长Gag中所示域相对应的示意图。图中蛋白质N端的深色波浪线代表肉豆蔻酸。CA中的点表示NTD或CTD丙氨酸替换；NC中的星号表示NC15A。右侧表格总结了扫描荧光测定的结果，描述为强FRET（左栏）、中等FRET或在某些情况下，轻微可检测FRET（+/-）（中栏）或未检测到FRET（右栏）。
图2。
图2。
Gag-Gag FRET的肉豆蔻酰化要求。图为细胞悬浮液在433nm激发后的发射扫描；527 nm处的峰值代表CFP/YFP FRET。右边的横线表明，每次比较中YFP受体浓度大致相等。每个面板下面都提供了符号的图例。
图3。
图3。
膜浮选离心SrcCANC（A）和Myr（−）SrcCANCB（B）。细胞裂解物分层在50%-40%-10%碘克沙醇梯度的底部，并进行平衡浮选离心以将膜（40%-10%界面）与细胞液（6至12组分）分离。顶栏表示CFP荧光是膜或胞浆中总Gag蛋白的标记。底部曲线表示每个梯度分数的发射扫描。
图4。
图4。
Gag-CFP/YFP成对结构面板的发射扫描结果。SrcCANC在每个帧中充当FRET正向控制。由于空间考虑，YFP发射值未显示在该面板中，但每次比较的强度大致相同。每个面板都包含一个键，指示所检查的特定构造。结果中提供了A到J中每次比较的详细信息。
图5：。
图5：。
膜浮选离心分离SrcCASP1LZ（A）和Myr（−）SrcCASP2LZ（B）。将细胞裂解物分层到50%-40%-10%碘克沙醇梯度的底部，并进行平衡浮选离心以将膜（40%-10%界面）与细胞液（6至12组分）分离。顶栏表示CFP荧光是膜或胞浆中总Gag蛋白的标记。底部曲线表示在用433nm光刺激之后每个单独梯度部分的发射扫描。
图6。
图6。
FRET救援实验。将SrcCANC-CFP与与YFP融合的每个指定的非淀粉化结构体共转染，并进行发射扫描以检测FRET。符号键位于YFP强度条下方。除Myr（−）SrcCA（M39A/W184A）NC15A和Myr（–）SrcCA（M39A/W184A/M185A）NC15 A外，所有结构均显示FRET被肉豆蔻酰化结构所拯救，这两个结构分别表示为垂直线和菱形。
图7。
图7。
关键Gag融合蛋白的激光扫描共聚焦荧光显微镜。图中显示的是使用蔡司LSM 510共焦显微镜检测的与配对结构的YFP融合伙伴转染的HeLa细胞。肉豆蔻酰化结构如左图所示，非肉豆蔻醇化结构如右图所示。DAPI（4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚）复染用于提供核染色。（A） MACANC；（B） Myr（−）MACANC；（C） SrcCANC；（D） Myr（−）SrcCANC；（E） SrcCASP1LZ公司；（F） Myr（−）SrcCASP1LZ；（G） ScrCA（M39A/W184A/M185A）NC15A；（H） Myr（−）ScrCA（M39A/W184A/M185A）NC15A。
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